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第一部分NEK2蛋白的制备目的:通过原核表达系统表达人NEK2蛋白,并对蛋白表达条件进行优化,纯化NEK2蛋白。方法:1.从人HL7702细胞中提取Total RNA,逆转录成cDNA后,以cDNA为模板通过PCR扩增NEK2基因,将NEK2全长基因连接到pET30a（+）质粒上,构建pET30a（+）-NEK2载体。通过对单克隆菌的菌液进行PCR反应,对pET30a（+）-NEK2重组质粒进行Bam HⅠ酶和Sa1Ⅰ酶双酶切反应,挑取菌液PCR和双酶切验证阳性的单克隆菌送去测序验证pET30a（+）-NEK2载体。2.将pET30a（+）-NEK2载体转化大肠杆菌BL21（DE3）中,加入IPTG诱导剂诱导蛋白表达,分析蛋白表达形式;分别于18℃、28℃、37℃、42℃不同诱导温度诱导5 h,确定最适诱导温度;根据最适诱导温度加入0.2 mmol/L、0.4 mmol/L、0.6 mmol/L、0.8 mmol/L、1.0 mmol/L不同浓度的IPTG诱导剂,确定最适IPTG浓度;根据最适温度和最适IPTG浓度,分别于4 h、8 h、12 h、16 h、20 h、24 h、28 h、32 h、36 h不同时间条件下诱导蛋白表达,确定最佳诱导时间。3.通过KCl负染方式切胶纯化NEK2蛋白,BCA试剂盒测定蛋白浓度,凝胶成像系统分析蛋白纯度。4.通过Western blot和质谱技术对纯化的NEK2蛋白进行鉴定。结果:1.对单克隆菌的菌液进行PCR验证,在约1 338 bp处出现单一明亮清晰的条带,与预期的NEK2目的基因长度相符;对pET30a（+）-NEK2重组质粒进行Bam HⅠ酶和Sa1Ⅰ酶双酶切验证,在约1 338 bp和5 500 bp处均出现单一明亮清晰的条带,与预期的NEK2目的基因和pET30a（+）质粒长度相符;挑取菌液PCR和双酶切验证阳性的单克隆菌送去测序,测序结果与NEK2目的基因序列一致。说明成功构建了pET30a（+）-NEK2载体。2.成功表达的NEK2蛋白为包涵体蛋白,蛋白表达的最佳条件为37℃条件下加入0.2 mmol/L的IPTG进行诱导8 h。3.NEK2经KCl负染切胶纯化后,12%SDS-PAGE胶考马斯亮蓝染色结果显示,在58 k Da处有一明显的蛋白条带,且周围无明显杂带,与预期的NEK2蛋白大小相符;纯化的NEK2蛋白浓度为2.21 mg/m L,蛋白纯度大于95%。4.Western blot检测蛋白结果可知,在58 k Da处有一明显的蛋白条带,且周围无明显杂带,与预期的NEK2蛋白大小相符,且随着重组蛋白含量的增加条带的亮度也随之递增,说明重组蛋白能被抗His单克隆抗体特异性识别;质谱分析结果经Mascot检索比对,共鉴定出8条多肽,与Uniprot数据库中的人NEK2蛋白氨基酸序列完全匹配,说明原核表达的蛋白为NEK2蛋白。结论:构建了pET30a（+）-NEK2载体,且制备了浓度高、纯度高的NEK2蛋白。第二部分抗NEK2单克隆抗体的制备与应用目的:通过杂交瘤技术制备抗NEK2单克隆抗体,并初步应用于肝癌细胞的亚定位和抑制肝癌细胞的增殖活性研究。方法:1.将纯化的NEK2蛋白通过皮下多点注射方式免疫BALB/c小鼠,8周后,取小鼠尾静脉血检测小鼠抗血清效价。2.取小鼠抗血清效价最高的小鼠B淋巴细胞与SP2/0骨髓瘤细胞通过PEG融合剂进行融合,HAT培养基筛选阳性杂交瘤细胞,间接ELISA法检测杂交瘤细胞效价。3.有限稀释法亚克隆阳性杂交瘤细胞,筛选出能稳定分泌抗NEK2抗体的单克隆细胞株,间接ELISA法检测单克隆细胞效价和亚型。4.采用腹水诱生法大量生产抗NEK2单克隆抗体,通过NHS-活化琼脂糖树脂纯化抗体,凝胶成像系统分析纯化后的抗体纯度,间接ELISA法检测单克隆抗体效价、亚型和亲和力常数（Ka）。5.通过Western blot和间接ELISA法检测抗NEK2单克隆抗体特异性。6.将抗NEK2单克隆抗体应用于免疫荧光试验,检测NEK2亚细胞定位。将抗NEK2单克隆抗体应用于免疫细胞化学染色试验,检测NEK2在人HL7702、HepG2和Hep3B细胞中的表达情况,并与qPCR检测NEK2在人HL7702、HepG2和Hep3B细胞中mRNA相对表达量进行比较。7.将浓度分别为5μg/m L、25μg/m L、50μg/m L、100μg/m L的抗NEK2单克隆抗体与HepG2和Hep3B肝癌细胞进行共培养,用MTT法检测不同浓度的抗NEK2单克隆抗体对HepG2和Hep3B肝癌细胞的细胞活性的影响。结果:1.NEK2小鼠抗血清效价大于1:243 000。2.NEK2单克隆细胞效价大于1:729 000,亚型为IgG1型。3.用NHS-活化琼脂糖树脂纯化NEK2抗体,纯化后的抗NEK2单克隆抗体进行10%SDS-PAGE,考马斯亮蓝染色结果显示,在55 k Da和25 k Da处分别有2条明显的条带,分别为抗体分子的重链和轻链,凝胶成像系统拍照分析,纯化后的抗体纯度大于90%。4.纯化后的单克隆抗体效价大于1:729 000,亚型为IgG1型,Ka为6.0×10~8L/mol。5.Western blot检测抗NEK2单克隆抗体特异性,结果显示,纯化的NEK2在58 k Da处出现单一的特异性条带,且随着NEK2含量的增加条带的亮度也随之递增;间接ELISA法检测结果显示抗NEK2单克隆抗体能特异性识别NEK2,与Western blot实验结果一致。6.通过免疫荧光试验检测人HL7702、HepG2和Hep3B细胞中NEK2的定位,结果显示NEK2主要定位于细胞质,少量定位于细胞核。7.免疫细胞化学染色法检测NEK2在人HL7702、HepG2和Hep3B细胞中的表达,结果显示NEK2在HepG2和Hep3B肝癌细胞中的阳性表达明显高于人HL7702正常肝细胞,且主要定位于细胞质。采用Image-Pro Plus6.0图像分析软件对免疫细胞化学染色图像进行定量分析,结果表明NEK2在HepG2（0.1217±0.00408）和Hep3B（0.15±0.1549）肝癌细胞的表达水平显著高于人HL7702正常肝细胞（0.0967±0.00816）（P<0.05）。8.用qPCR法检测NEK2 mRNA在人HL7702、HepG2和Hep3B细胞中的相对表达量,结果表明NEK2 mRNA在HepG2（1.1611±0.16602）和Hep3B（1.5700±0.30381）肝癌细胞中的表达水平显著高于人HL7702正常肝细胞（1.0011±0.04833）（P<0.05）,与免疫细胞化学染色法检测结果一致。9.当抗NEK2单克隆抗体浓度为50μg/m L时,与HepG2细胞共培养72 h后,细胞活性受到抑制（P<0.05）,抑制率为19.24%;当抗NEK2单克隆抗体浓度为100μg/m L时,与HepG2和Hep3B细胞共培养48 h和72 h后,细胞活性受到明显抑制（P<0.05）;培养48 h后,HepG2和Hep3B细胞活性抑制率分别为25.99%和11.06%（P<0.05）;培养72 h后,HepG2和Hep3B细胞的活性抑制率分别为26.34%和14.43%（P<0.05）。说明制备的抗NEK2单克隆抗体能抑制肝癌细胞的增殖。结论:本研究制备了高效价、高亲和力和高特异性的抗NEK2单克隆抗体,为NEK2快速诊断试剂盒和胶体金检测试纸条研发提供了良好的抗体工具;为抗肿瘤药物的研发提供了基础数据。