蛋白激酶Cγ在慢性神经痛和吗啡耐受痛觉调控中的作用研究背景和目的近十年来，慢性疼痛的研究取得了很大的进展，痛觉传导通路的中枢敏化被认为是慢性疼痛产生和维持的重要原因。然而，到目前为止，仍然缺乏一种十分有效的阻断中枢敏化进程的治疗药物或干预手段。阿片类作为最强效镇痛物质，虽然在疼痛研究中使用十分普遍，但其对慢性疼痛的镇痛疗效十分有限，而且使用方法不当或长期使用，能产生比疼痛刺激本身更为严重的痛觉过敏现象，导致阿片耐受和依赖等问题。因此，寻求一种能特异性阻断慢性疼痛痛觉过敏产生途径的干预手段日益受到关注。反义寡核苷酸技术正是由于其寡核苷酸分子能够特异性结合并阻断靶基因mRNA转录、翻译，从而起到抑制有害目的基因表达的特点，而被引用至慢性疼痛研究领域，并有望对慢性疼痛过程中某些特定基因干扰而起到治疗作用。 痛觉传导通路的中枢敏化机制十分复杂，痛觉过敏现象是慢性疼痛和吗啡耐受过程中所共有的症状，脊髓背角神经元的可塑性变化是痛觉过敏产生的形态学基础，也是阿片类药物镇痛作用逐渐减弱的重要因素之一。大量研究资料表明，慢性疼痛和吗啡耐受两者在细胞内机制上具有相似性，都是以NMDA受体激活为触发机制的细胞内级联反应，然而仅仅NMDA受体激活不足以导致脊髓神经元持续超兴奋状态，后者依赖于NMDA受体激活后下游第二信使系统的改变，蛋白激酶C作为NMDA受体下游事件，它的激活对诱发细胞内级联反应起极为重要作用，其激活后不仅通过(1)磷酸化膜受体和离子通道蛋白质而使兴奋性氨基酸受体如NMDA、AMPA兴奋性增强；而且使μ-阿片受体磷酸化，与G蛋白脱偶联，导致受体失活、内吞，受体数目下调，从而发生阿片类抗痛效应下降，导致痛觉过敏和吗啡耐受。此外，激活的蛋白激酶C还可通过(2)调节基因表达，使神经元产生可塑性变化，导致痛觉传递神经元的敏化。从而使脊髓神经元将无害刺激信号转化为伤害性刺激信号源源不断上传至中枢神经系统，最终导致痛觉传导通路的中枢敏化。 蛋白激酶Cγ(ProteinKinaseCgamma,PKCγ)作为经典型PKC超家族成员之一，是近年来发现的与慢性疼痛的维持，以及吗啡耐受产生密切相关的细胞内第二信使分子，仅分布于脑和脊髓的神经元。在脊髓，PKCγ高限制性分布于背角胶状质Ⅱ层内侧的中间神经元的亚丛以及背侧皮质脊髓束的轴突，正常情况下表达量极少，见于神经元的胞浆和树突棘。在慢性坐骨神经收缩损伤以及部分坐骨神经切断后，小鼠的脊髓背角PKCγ表达量上调，然而将PKCγ基因敲除后，基因缺陷小鼠对神经损伤后的机械刺激的痛阈不发生改变，而野生型小鼠则表现出机械缩爪阈值明显降低。说明PKCγ与外周神经损伤后，神经病理性疼痛发展密切相关。此外，长期鞘内使用吗啡也可显著增加小鼠脊髓PKCγ的表达水平，而PKCγ基因敲除小鼠重复使用μ-阿片受体激动剂，则不会引起由激动剂所致的G-蛋白激活脱敏感。由此可见，PKCγ除了对慢性疼痛时神经元持续激活起重要作用，同时也是μ-阿片受体介导的吗啡耐受的关键分子。 基于PKCγ在慢性疼痛和吗啡耐受痛觉过敏产生过程中的重要作用。我们首先对慢性神经损伤(CCI和SNL)后，实验大鼠痛觉行为学的变化，以及脊髓背角PKCγ表达的改变进行研究，然后利用反义技术来特异性下调PKCγ目的基因的表达，通过观察(1)反义PKCγ寡核苷酸鞘内注射对慢性坐骨神经痛大鼠痛阈和脊髓PKCγ蛋白质表达的影响；以及(2)慢性吗啡耐受大鼠反义干扰对耐受的逆转效应，来探讨PKCγ参与痛觉过敏中枢敏化的可能机制，为反义寡核苷酸技术用于基因功能研究和进一步用于慢性疼痛的干预提供理论依据。 研究内容 1.离体水平为检验我们所设计的反义PKCγ寡核苷酸分子是否能有效下调PKCγ的表达，首先将正、反义寡核苷酸分子转染至体外培养的大脑皮层和海马神经元，观察转染PKCγ寡核苷酸对神经元生长增殖的影响，以及神经元PKCγmRNA的表达改变。 新生0～1dSD大鼠50只，取材原代培养。实验分为正常对照组(Ⅰ组，n=10)，空脂质体转染组(Ⅱ组，n=10)，正义PKCγ300nmol/L组(Ⅲ组，n=10)，反义PKCγ100nmol/L组(Ⅳ组，n=10)，反义PKCγ300nmol/L组(Ⅴ组，n=10)。原代培养第4～5d的海马及皮层神经元，采用脂质体或脂质体包裹的不同浓度的AsODN或SODNPKCγ转染培养神经元，采用倒置显微镜对神经元的生长进行动态观察，免疫组化ABC法鉴定PKCγ阳性神经元，MTT法检测神经元的增殖率，半定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术检测转染反义PKCγ寡核苷酸后神经元的PKCγmRNA的表达变化。 2.在体水平在体外细胞水平得到反义PKCγ寡核苷酸能下调PKCγmRNA的表达后，将其用于慢性神经痛和吗啡耐受大鼠鞘内，然后对两种动物模型的痛觉过敏现象、腰段脊髓水平PKCγmRNA及蛋白质表达变化进行观察。 2.1慢性神经痛时脊髓背角PKCγ、PKCα和Fos表达改变的研究24只雌性SD大鼠随机分为3组：假手术组；CCI组；SNL组；各组大鼠分别制备相应的动物模型，假手术组仅将右侧坐骨神经暴露5分钟；CCI组将右侧坐骨神经4/0肠线松弛结扎4个单结；SNL组将L5脊神经用丝线紧密结扎1个单结并切断，与术前2d、术后2、4、7dVonFreyhairs机械痛阈测试，免疫组化ABC法检测脊髓PKCα、γ阳性产物和Fos阳性神经元的表达。 2.2反义PKCγ寡核苷酸对慢性神经痛影响的研究24只雌性SD大鼠随机分为4组：CCI组；CCI+SODN20ug组；CCI+AsODN5ug组；CCI+AsODN20ug组；CCI模型制作后即行鞘内置管术，除CCI组外，其余三组均于鞘内注入相应剂量的PKCγSODN或AsODN，每日一次，连续6d；观察各组大鼠疼痛行为学表现，Westernblot法检测脊髓PKCγ、α蛋白质表达。 2.3反义PKCT寡核苷酸对吗啡耐受效应的研究24只雌性SD大鼠随机分为4组，即Ⅰ：假处理组；Ⅱ：慢性吗啡耐受+生理盐水处理组；Ⅲ：慢性吗啡耐受+SODN20ug处理组；Ⅳ：慢性吗啡耐受+AsODN20ug处理组；除Ⅰ组鞘内注射20ul生理盐水处理外，Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组分别于鞘内注入10ug/10ul吗啡，每日2次，连续6d，然后再经鞘内分别注入20ul生理盐水、20ug/10ulPKCγSODN或AsODN，每日一次，连续6d，采用辐射热测痛仪检测大鼠缩爪潜伏期变化，RT-PCR方法检测脊髓PKCγmRNA的表达，Westernblot-ECL增强化学发光法检测脊髓PKCγ、α蛋白质表达。 研究结果 (略） 研究结论 1.本研究所设计的反义PKCγ寡核苷酸能特异性下调神经元PKCγmRNA的表达，在转染早期促进原代培养神经元的增殖，在转染晚期抑制神经元生长增殖，此种效应与PKCγ对神经元生长起负性调控有关。 2.慢性神经损伤后实验动物表现出对机械刺激的痛觉过敏现象，脊髓背角PKCγ、α，Fos蛋白免疫阳性物质明显增加，此种现象说明PKCγ、α参与神经损伤后脊髓背角神经元持续兴奋的可塑性变化。 3.反义PKCγ寡核苷酸鞘内注射后可特异性抑制PKCγ蛋白质表达，并使慢性神经痛大鼠的痛觉过敏减轻，该作用可能是PKCγ蛋白质表达下调后，其活性降低，抑制NMDA受体磷酸化程度，从而阻断慢性神经痛中枢敏化正反馈环路。 4.PKCγ蛋白质的激活使NMDA受体和μ-阿片受体的磷酸化，是导致慢性吗啡耐受的产生的重要原因，反义PKCγ寡核苷酸能有效缓解吗啡耐受形成后实验动物痛敏行为学的改变，此种作用是通过下调脊髓PKCγ蛋白质的表达来实现的。 5.PKCγ在慢性神经痛和吗啡耐受痛觉过敏产生中起关键作用，反义PKCγ寡核苷酸鞘内注射能够有效缓解两者的疼痛行为学改变，并减少腰段脊髓PKCγ蛋白质的表达水平。