背景:视网膜变性疾病(retinal degeneration,RD)是一类以视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium,RPE)细胞或/和视网膜光感受器细胞功能异常而引起视网膜光感受器细胞凋亡为病理改变的致盲性眼病。RD的治疗包括细胞移植、基因治疗、药物治疗和人工视网膜假体等。眼部细胞移植具有可操控性,效果易于评价,是国内外研究的热点。视网膜前体细胞(retinal precursor cell,RPC)、诱导多潜能干细胞(induced pluripotent stem cell,iPSC)、胚胎干细胞(embryonic stem cell,ESC)等多种来源的种子细胞用于移植至RD动物模型视网膜下腔,以观察细胞移植治疗视网膜变性疾病的效果。组织特异性来源的RPC在体外可悬浮或贴壁培养,有一定的增殖能力和分化能力,移植至RD动物模型的视网膜下腔后可在一定程度上延缓视网膜变性的发展和改善视网膜功能。然而,组织特异性来源RPC来源局限,限制了其作为临床转化细胞的应用。iPSC可经患者自身成熟细胞诱导而来,具有较强的增殖能力和分化能力,在一定程度上减少了免疫排斥问题,将其来源的RPC移植至视网膜变性动物模型的视网膜下腔,可在一定程度上延缓视网膜变性的发展和改善视网膜功能。但是iPSC的转化效率较低,增加了其作为移植细胞的成本和难度。目前,经美国食品与药品管理局(Food and Drug Administration,FDA)批准,人胚胎干细胞(human embryonic stem cell,hESC)来源的RPE细胞可用于Stargardt病和干性年龄相关性黄斑变性(Age-related Macular Degeneration,AMD)的Ⅰ/Ⅱ期临床实验,研究结果显示在平均22月的随访中,移植细胞可以改善或维持部分患者的视功能,没有发现异常增殖。本研究选择用hESC作为研究对象,拟利用人胚胎干细胞来源的视网膜前体细胞作为移植细胞观察其对RD的治疗作用。本研究共分为三部分:第一部分:检测本实验室hesc的干性特征和增殖能力。第二部分:由hesc定向向视网膜前体细胞诱导分化,并对诱导分化过程中各个阶段用细胞免疫荧光(immunocytochemistry,icc),流式细胞术(flowcytometry,fcm)和细胞周期检测等方法进行鉴定,了解hesc在体外分化的生物学特性,明确适合于眼部移植细胞的发育阶段。人胚胎干细胞作为临床转化细胞的一个重大问题是其具有致瘤性。由于胚胎干细胞的无限增殖能力,其在宿主体内可能会无限增殖而致瘤。阶段特异性胚胎表面抗原(stage-specificembryonicantigens,ssea)是胚胎干细胞的特异性标记物,在人胚胎干细胞中表达为阶段特异性胚胎表面抗原4(stage-specificembryonicantigen4,ssea4)。因此,为了降低hesc来源的细胞在宿主体内的致瘤性,本实验在进行细胞移植前,拟采用流式细胞分选术(fluorescence-activatedcellsorting,facs),用反向选择的方法,将诱导分化过程中残留的ssea4阳性的人胚胎干细胞排除,选择ssea4阴性的hesc来源rpc作为移植细胞,检测移植细胞的致瘤风险。第三部分:在第二部分的基础上,借助流式细胞分选术,将hesc来源的视网膜前体细胞用反向选择的方法排除ssea4阳性的细胞。将筛选的ssea4阴性的视网膜前体细胞移植至视网膜变性疾病动物模型皇家外科学院(royalcollegeofsurgeon,rcs)大鼠视网膜下腔,以评估hesc来源的rpc移植治疗视网膜变性疾病的效果;同时,将hesc来源的rpc移植至严重联合免疫缺陷小鼠皮下,以评估其安全性,为hesc向临床转化治疗rd提供理论依据。第一部分人胚胎干细胞的培养鉴定及拟胚体的形成目的:检测人胚胎干细胞的干性标记和增殖能力;探索适合于本研究的拟胚体(embryonicbody,eb)形成方法。方法:体外培养人胚胎干细胞株h1,采用细胞免疫荧光染色、流式细胞检测术、细胞周期检测和细胞增殖曲线绘制等方法对人胚胎干细胞标记物ssea4及细胞株h1的增殖能力进行鉴定。比较悬浮培养法、悬滴培养法及aggrewelltm400培养板培养法形成的拟胚体的数量和大小。结果:1.体外培养的单个人胚胎干细胞特点:体积小,核大,核与细胞质的比例高。细胞集落特点为界限清晰,中心区发亮。2.流式细胞术检测结果表明,不同代数p42、p47和p52人胚胎干细胞ssea4阳性比例分别为97.88±2.21%,98.04±1.85%和98.00±2.02%,差异无统计学意义(p>0.05)。细胞免疫荧光染色数据分析结果显示,p42、p47和p52人胚胎干细胞ssea4阳性比例分别为97.22±2.11%,96.37±3.55%和96.33±3.44%,差异无统计学意义(p>0.05)。3.流式细胞术及细胞免疫荧光染色检测细胞增殖标记物ki67的阳性表达率,分别为98.50±3.01%和99.60±1.80%。细胞周期检查结果显示,66.24±3.27%细胞处于细胞周期的增殖期(g2/m和s期)。增殖曲线显示hesc在传代培养第5天达到增殖平台期,细胞可增殖30倍以上。4.以种1ml细胞重悬液所形成eb数量来计算,悬滴培养法得到小直径eb数量为0.33±0.58,中等大小eb数量为37.33±0.58,大直径eb数量为0.67±0.58,中等大小eb数量与所形成的小直径eb数量相比较具有明显差异(p<0.001),与大直径eb数量相比较具有明显差异(p<0.001),小直径eb数量与大直径eb数量相比较差异没有统计学意义((p>0.05)。悬浮培养法得到的小直径eb数量为323.33±25.17,中等大小eb数量为348.33±25.66,大直径eb数量为373.68±15.14,中等大小eb数量与小直径eb数量相比较差异没有统计学意义(p>0.05),与大直径eb数量相比较差异没有统计学意义(p>0.05),小直径eb数量与大直径eb数量相比较没有明显差异(p>0.05)。用aggrewelltm400培养板培养方法,我们得到的小直径eb数量为74.33±5.86,中等大小eb数量为906.68±60.28,大直径eb数量为66.33±5.51,中等大小eb数量与小直径eb数量相比较具有明显差异(p<0.001),与大直径eb数量相比较具有明显差异(p<0.001),小直径eb数量与大直径eb数量相比较差异没有统计学意义((p>0.05)。悬滴培养法及aggrewelltm400培养板培养法所形成eb直径大小相对均一。三种方法均以种细胞1ml细胞重悬液所形成eb数量来计算。悬滴培养法形成总eb数量为38.33±0.58;悬浮培养法形成的总eb数量为1045.33±62.32,与悬滴培养法所形成eb数量相比较,具有明显的统计学差异(p<0.001);aggrewelltm400培养板培养法所形成的eb数量约为1047.33±51.39,与悬滴法培养所形成eb数量相比较,具有明显的统计学差异(p<0.001),与悬浮培养法所形成总的eb数量相比较,没有明显的统计学差异(p>0.05)。悬浮培养法与aggrewelltm400培养板培养法所形成拟胚体数量较大,与悬滴培养法相比较具有显著统计学意义(p<0.001)。结论:1.人胚胎干细胞株h1具有传代稳定性,能够维持人胚胎干细胞的增殖能力。2.悬滴培养、悬浮培养或aggrewelltm400培养板培养等方法均可形成eb,悬浮培养方法形成的eb具有数量大的优点,但是eb大小不均一;悬滴培养方法形成的eb具有大小均一的优点,但是数量相对有限;aggrewelltm400培养板的方法所形成的eb具有数量多,大小均一的优点。因此,本实验选择aggrewelltm400培养板形成eb的方法。第二部分人胚胎干细胞向视网膜前体细胞的定向分化目的:探索hesc在体外高效定向诱导分化为视网膜前体细胞的方法。方法:首先我们用aggrewelltm400培养板培养法将hesc在体外形成eb,然后将eb悬浮培养3天后换用视网膜前体细胞培养基贴壁培养,在培养的第10天,在视网膜前体细胞培养基中添加t3和taurine。在诱导分化培养的第0天、10天、20天、30天及40天,对分化细胞的形态和细胞标记物等进行鉴定。结果:1.hesc的细胞周期时相为g0/g1期占40.81±4.44%,s期占36.25±3.91%,g2/m期占22.95±3.21%;诱导分化第10天,g0/g1期、s器和g2/m期细胞分别占67.49±2.75%、19.38±3.25%和13.12±5.08%;诱导分化第20天,g0/g1期、s器和g2/m期细胞分别占80.70±1.59%、9.43±0.73%和9.87±0.97%;诱导分化第30天,g0/g1期、s器和g2/m期细胞分别占81.53±2.76%、6.23±1.54%和12.24±4.31%;诱导分化第40天,g0/g1期、s器和g2/m期细胞分别占88.89±1.45%、5.74±1.20%和5.37±1.16%。同一细胞周期时相与hesc的数据相比较,差异具有统计学意义(p<0.001)。2.流式细胞术及细胞免疫荧光检测显示hesc中ki67的阳性表达率为98.70±0.92%,在分化培养的第10天、20天、30天及40天,ki67的阳性率分别为86.40±5.54%,44.23±3.29%,15.10±4.32%,7.87±1.69%。细胞免疫荧光检测结果,分化第0天、10天、20天、30天和40天ki67的阳性表达率分别为97.70±0.92%,91.40±3.63%,42.90±2.52%,13.77±2.28%和7.20±2.39%。分化培养第10天与未分化状态相比较,ki67表达量下降,差异具有统计学意义(p<0.01);分化培养第20天与分化培养第10天相比较,ki67表达量下降,差异具有统计学意义(p<0.001);分化培养第30天,与分化培养第20天相比较,ki67表达量下降,差异具有统计学意义(p<0.001);分化培养的第40天,与分化培养第30天的细胞相比较ki67的表达量下降(p<0.05)3.hesc的标记物ssea4在细胞未分化时表达率为98.80±1.02%,在分化的第10天、20天、30天和40天,ssea4的阳性率分别为48.80±4.20%,7.64±1.13%,2.21±0.79%,0.93±0.44%,与前一个时间点相比较,差异均具有统计学意义(p<0.01)。4.流式细胞术检测,在诱导分化第0天、10天、20天、30天和40天,pax6的表达量分别为0.63±0.16%,34.73±2.10%,45.63±2.94%,30.97±2.12%,12.23±2.79%;sox2的表达量分别为0.40±0.27%,49.07±4.51%,69.47±4.58%,17.20±2.82%,11.10±1.99%;rax的表达量分别为0.31±0.18%,66.70±6.98%,46.77±6.69%,11.33±2.53%,9.70±1.87%;nestin的表达量分别为0.61±0.26%,82.10±6.86%,69.20±5.47%,23.00±6.06%,6.90±2.46%。免疫荧光半定量分析,在分化的第0天、10天、20天、30天和40天,pax6的表达量分别为0%,35.73±5.10%,44.69±4.38%,28.96±3.51%,11.69±3.58%;sox2的表达量分别为0%,50.88±3.42%,67.68±3.52%,18.34±3.12%,12.29±2.03%;rax的表达量分别为0%,65.68±7.15%,48.03±6.58%,10.24±2.47%,10.05±2.03%;nestin的表达量分别为0%,80.12±7.03%,67.20±5.64%,22.35±5.87%,7.09±2.74%。与前一个时间点相比较,差异均具有统计学意义(p<0.05)。5.在诱导分化0天、10天、20天、30天和40天,流式细胞术检测otx2表达量分别为0.49±0.16%,9.93±2.01%,65.40±5.57%,39.20±3.70%,21.10±3.89%;免疫荧光染色otx2表达量分别为0.49±0.16%,3.27±1.46%,61.07±3.45%,39.33±3.67%和21.67±4.33%。光感受器前体细胞标记物crx在分化第20天时检测到有表达,流式细胞术检测结果为8.17±1.48%,随后表达量逐渐增多,在分化第30天及40天时表达量分别为35.07±2.40%和49.30±5.10%。流式细胞术检测结果显示视网膜光感受器细胞标记物recoverin在分化的第0天、10天、20天、30天和40天的阳性表达率分别为0.24±0.18%,0.72±0.55%,6.77±0.95%,16.49±1.99%和24.14±3.04%。结论:1.hesc在诱导分化的过程中,细胞增殖能力逐渐下降。2.悬浮培养和贴壁培养相结合的方法,通过添加诱导因子,可以将hesc诱导为视网膜前体细胞和视网膜光感受器前体细胞。3.诱导分化第20天的细胞主要为视网膜前体细胞,我们选择诱导分化第20天的细胞进行下一步的实验。第三部分人胚胎干细胞来源视网膜前体细胞治疗视网膜变性疾病的有效性及安全性研究目的:探讨hesc来源的视网膜前体细胞移植至rcs大鼠视网膜下腔后的存活、迁移能力,及对视网膜结构和功能的影响,并进行安全性检测。方法:根据本实验第二部分的结果,我们选择体外分化培养第20天的细胞,用流式细胞分选术筛选ssea4阴性细胞,并用cm-dil标记,将其移植入出生后3周的rcs大鼠视网膜下腔,对移植后第4周、8周和12周视网膜下腔及外核层存活的细胞数量进行计数;对细胞治疗组、伪手术组和野生型大鼠组在细胞移植后第4周、8周和12周的视网膜进行免疫组织化学染色(immunohistochemistry,ihc),并测量视网膜外核层(outernuclearlayer,onl)厚度。同时对细胞移植组和伪手术组在移植手术进行前1天,移植手术进行后第4周、8周和12周的视网膜电图(electroretinogram,erg)进行检测。将12只严重联合免疫缺陷小鼠(severecombinedimmunedeficiency,scid)随机分为实验组和阳性对照组两组,分别在腹股沟皮下注射hesc来源rpc和hesc,观察是否有成瘤或其他病变。结果:1.移植术后第4周、8周和12周,移植细胞多位于穿刺点附件的视网膜下腔。移植术后第4周,视网膜轻度脱离;移植术后第8周,视网膜较移植后第4周时平伏,移植后第12周,视网膜较移植术后第8周时平伏。移植细胞在视网膜下腔可存活,并向外核层迁移。移植后第4周、8周及12周单个视野移植细胞的存活数量分别为7.77±0.97,5.87±0.42,4.33±0.61。单因素方差分析结果显示移植后第4周、8周及12周,细胞的存活数量差异具有统计学意义(p<0.01)。2.细胞治疗组外核层厚度在移植后第4周、8周及12周分别为28.60±1.84μm,23.32±0.84μm,19.82±1.18μm,与伪手术组视网膜外核层厚度7.12±1.01μm,6.70±0.52μm,4.22±0.73μm相比较,差异有统计学意义(p<0.05)。野生型大鼠视网膜外核层厚度在同周龄分别为44.74±1.31μm,44.84±1.92μm,45.82±3.29μm。细胞治疗组与野生型大鼠组相比较,差异有统计学意义(p<0.05)。3.细胞治疗组在移植前,移植后第4周、8周和12周的ergb波幅值分别为76.51±1.60μv,72.47±8.03μv,44.37±10.77μv和8.40±1.99μv;伪手术组在移植前,移植后第4周、8周和12周ergb波幅值分别为77.28±2.33μv,39.08±3.88μv,18.20±5.51μv和6.13±0.86μv。移植手术进行前及移植治疗手术后第12周,细胞治疗组与伪手术组ergb波波幅相比较,差异无无统计学意义(p>0.05),移植治疗手术后第4周及8周,细胞治疗组与伪手术组ergb波波幅相比较,差异有统计学意义(p<0.05)。4.安全性实验结果显示实验组和阳性对照组均未出现免疫排斥反应,实验组小鼠均未见畸胎瘤形成,阳性对照组出现畸胎瘤,发生率为33.3%。结论:1.人胚胎干细胞来源的视网膜前体细胞在RCS大鼠视网膜下腔可以存活、迁移,细胞的存活数量随移植时间的延长而减少。2.人胚胎干细胞来源的视网膜前体细胞在一定程度上保护RCS大鼠视网膜结构,延缓视网膜外核层的变性、萎缩和视网膜光感受器细胞的凋亡。3.人胚胎干细胞来源的视网膜前体细胞对RCS大鼠的ERG结果有一定的改善作用。4.初步安全性实验未发现hESC来源的RPC具有致瘤性,安全性检测尚需进一步的研究。