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研究目的:血管钙化(vascular calcification,VC)是心脑血管病变的中晚期进程,是钙磷结晶异位沉积的结果。血管钙化涉及多种骨/成骨蛋白的表达,与动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)等心血管疾病紧密关联。氧化型低密度脂蛋白(oxidized low density lipoprotein,ox LDL)是产生粥样斑块的关键脂质,其在体内的过度堆积引起细胞不能正常代谢继而发展成为泡沫细胞是AS的初始病理特点之一。研究发现自身免疫性疾病--抗磷脂综合征(antiphospholipid syndrome,APS)的患者普遍同时有动脉粥样硬化的临床特点,该类患者体内存在丰富的β2GPI自身抗原(β2 glycoprotein I antigen)和抗β2GPI自身抗体(β2 glycoprotein I antibody),与ox LDL结合成复杂的ox LDL/β2GPI/anti-β2GPI三者复合物,对患者产生负面作用。血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cell,VSMC)是位于血管中膜层的一种可塑力很强的细胞,在AS发展中,平滑肌细胞除了能够分泌许多特定炎性分子,还能发生表型转变从而同时拥有其他细胞的功能:如向巨噬细胞转变,吞噬脂质;向成骨细胞转变,促进钙化。本课题组前期的结果证实了ox LDL/β2GPI/anti-β2GPI复合物通过TLR4-JNK1/2信号分子介导大鼠胸主动脉平滑肌细胞(A7r5)巨噬样转变并影响脂质转运,然而对于细胞钙化及其潜在机制还缺乏具体的研究,因此本文进一步探究了ox LDL/β2GPI/anti-β2GPI复合物是否能通过炎症分子介导A7r5细胞发生骨/成骨样转化,以及TLR4通路在其中是否发挥相关功能。研究方法:(1)利用茜素红染色观察不同刺激条件(ox LDL、ox LDL/β2GPI、ox LDL/anti-β2GPI、β2GPI/anti-β2GPI、ox LDL/β2GPI/anti-β2GPI、TAK-242+ox LDL/β2GPI/anti-β2GPI、及2.6 mmol/L高磷)对A7r5细胞钙化颗粒的形成影响。(2)实时荧光定量PCR(Real-time quantitative PCR,RT-q PCR)和蛋白免疫电泳(Western blot)检测由ox LDL、ox LDL/β2GPI、ox LDL/anti-β2GPI、β2GPI/anti-β2GPI、ox LDL/β2GPI/anti-β2GPI刺激后,SM22α、Runx2的m RNA和蛋白水平。使用TLR4阻断剂对细胞预先干预后,采用同样方法观察各项指标的改变情况。(3)酶联免疫吸附实验(ELISA)检测由ox LDL、ox LDL/β2GPI、ox LDL/anti-β2GPI、β2GPI/anti-β2GPI、ox LDL/β2GPI/anti-β2GPI刺激后A7r5细胞表达ALP、TNF-α的情况。(4)采用不同浓度TNF-α刺激A7r5,RT-q PCR和Western blot检测细胞SM22α和Runx2的m RNA和蛋白表达变化。研究结果:(1)ox LDL(50μg/m L)/β2GPI(100μg/m L)/anti-β2GPI(100μg/m L)复合物处理后,A7r5细胞深色钙化颗粒增加,效应强于其他刺激物。TLR4抑制剂(TAK-242)处理后钙化颗粒减少,较media有显著差异(p<0.01)。(2)ox LDL/β2GPI/anti-β2GPI复合物处理后,A7r5细胞SM22α的m RNA和蛋白水平下降,Runx2和ALP则表达上升,其变化程度强于其他刺激组,与空白对照比较差异显著(p<0.05)。TAK-242预处理阻断TLR4通路后,可以部分逆转细胞向骨/成骨细胞转化,SM22α和Runx2的表达均有所恢复。(3)ox LDL/β2GPI/anti-β2GPI复合物处理后,A7r5细胞表达TNF-α蛋白水平升高,与空白组比较有显著差异(p<0.05)。不同浓度的TNF-α可以减少SM22α表达,提高Runx2表达,50 ng/m L TNF-α刺激时SM22α降至最低,Runx2升至最高。结论:(1)ox LDL/β2GPI/anti-β2GPI复合物能够减少A7r5细胞表面收缩标志SM22α水平,提高骨/成骨细胞标志物Runx2、ALP表达,促进细胞钙化,TLR4抑制剂可逆转这一过程,提示TLR4在ox LDL/β2GPI/anti-β2GPI诱导A7r5细胞钙化中发挥重要作用。(2)ox LDL/β2GPI/anti-β2GPI复合物能够增加A7r5细胞炎症相关因子TNF-α表达,而TNF-α能够诱导A7r5发生细胞钙化,提示ox LDL/β2GPI/anti-β2GPI复合物可能是通过炎症分子促进细胞发生钙化。提示降低炎症分子的表达可能会有效减缓细胞钙化进程。