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猪圆环病毒2型(PCV2),一种单股环状DNA病毒,是引起猪圆环病毒相关疾病的重要病原之一。PCV2的主要靶细胞是单核巨噬细胞系统,其所引起的断奶仔猪多系统衰竭综合征以淋巴细胞衰竭、炎性细胞浸润为特征,造成机体的免疫功能抑制,继而易引起其他细菌和病毒等病原体的继发感染,给世界养猪业带来了巨大的经济损失。泛素蛋白酶体途径是调节真核细胞内蛋白质水平的重要途径之一,除了降解细胞内大量蛋白质外,其还参与调节细胞凋亡和分化、细胞周期进程、信号转导通路、炎性反应、蛋白质合成等。鉴于泛素蛋白酶体途径在细胞内重要的生理学意义,很多病毒利用其来满足自身需要,如病毒复制(包括病毒吸附、转录、翻译、组装和释放)、病毒的免疫逃逸、癌症进程、疾病过程等。目前PCV2感染和泛素蛋白酶体途径的相互作用尚未见报道。本研究首先验证了感染PCV2的猪肺泡巨噬细胞差异蛋白质的表达,然后从泛素蛋白酶体途径着手,分析了泛素蛋白酶体途径对PCV2复制的影响,以及泛素蛋白酶体途径相关的差异蛋白质(PSME1和PSMB2)在PCV2致病机理中的作用。具体研究内容如下：1.蛋白质组学分析感染PCV2的猪肺泡巨噬细胞差异蛋白质的验证本实验室前期通过比较蛋白质组学分析感染了PCV2的猪肺泡巨噬细胞,成功筛选到32个差异表达的蛋白质。在此基础上,我们对差异表达的蛋白质进行动态学分析、相对实时荧光定量验证、Western blot分析、差异表达蛋白质β-tubulin和PCV2的ORF2蛋白质的共定位验证,最终成功鉴定到21个差异表达的蛋白质,包括9个差异倍数(PCV2感染/未感染)大于2的蛋白质和12个差异倍数在1.5-2.0之间但确定差异表达的蛋白质,这些蛋白质涉及到细胞骨架组成、大分子生物合成、信号转导、应激反应、泛素蛋白酶体途径和代谢途径等。结果揭示了PCV2感染导致猪肺泡巨噬细胞生理学功能的紊乱,为研究PCV2致病机理提供了线索。2.泛素蛋白酶体途径对PCV2复制的影响为了解析泛素蛋白酶体途径和PCV2的相互作用,我们首先分析了泛素蛋白酶体途径对PCV2复制的影响。将蛋白酶体抑制剂(MG132和Lactacystin)作用于PK15细胞,观察其对PCV2滴度的影响。结果发现MG132和Lactacystin显著降低PCV2的DNA拷贝数。进一步分析发现MG132和Lactacystin并不影响PCV2的吸附,但显著抑制病毒ORF2的转录和蛋白质合成。说明抑制泛素蛋白酶体途径通过降低PCV2ORF2的转录和蛋白质表达来损伤PCV2的复制。3.蛋白酶体抑制剂引起PK15细胞G2/M期捕获文献报道蛋白酶体抑制剂损伤细胞周期进程,如诱导S期和G2/M期捕获,引起细胞凋亡等。鉴于PCV2是感染真核细胞最小的DNA病毒,其复制依赖于细胞周期进程表达的蛋白质。为了进一步分析泛素蛋白酶体途径是否通过介导细胞周期进程来调节PCV2的复制,我们通过流式细胞术分析了蛋白酶体抑制剂对感染了PCV2的PK15细胞周期的影响。结果显示蛋白酶体抑制剂MG132(?) Lactacystin并不引起细胞凋亡和S期变化,但呈剂量依赖性的延长G2/M期,使PK15细胞呈现G2/M捕获,损害了细胞周期进程。该结果提示了泛素蛋白酶体途径介导细胞周期进程调节PCV2的复制。4.PCV2感染可能与蛋白质泛素化相关泛素蛋白酶体途径包括2个重要的步骤：底物蛋白质与泛素的共价连接,进行底物蛋白质的泛素化；泛素化的蛋白质经26S蛋白酶体降解生成多肽,并释放出游离的泛素。为了进一步揭示PCV2感染和泛素蛋白酶体途径的相互作用,我们分析PCV2感染对细胞内蛋白质的泛素化水平和蛋白酶体活性的影响,发现PCV2感染加剧细胞内蛋白质的泛素化,但并不影响蛋白酶体的糜蛋白酶样活性。同时,针对泛素的siRNA也降低了PCV2滴度,说明PCV2感染可能和蛋白质的泛素化相关。5. PSME1参与PCV2所引起的炎性反应PSME1(蛋白酶体激活物28的α亚基)参与蛋白酶体的激活和MHC I类分子介导的抗原递呈。本研究中,在PK15细胞中过表达PSME1,并不影响PCV2的DNA拷贝数,但增加ORF2蛋白质的表达。同时,PSME1激活NF-κB信号通路,在48hpi使细胞因子IL-6、IL-8和TNF-a转录水平上调。但在感染PCV2后,虽然PSME1仍保持对NF-κB信号通路的激活作用,但细胞因子IL-6. IL-8和TNF-α转录水平下调。表明PSME1和PCV2存在相互作用,可能参与PCV2相关的免疫逃逸,并影响了PSME1和PCV2对细胞因子的上调作用。6. PSMB2经由NF-κB信号通路调节PCV2的复制PSMB2(蛋白酶体p2亚基)是蛋白酶体三个催化水解活性位点之一,具有胰蛋白酶样活性。过表达PSMB2的PK15细胞在PCV2感染后48h以内增加PCV2DNA拷贝数和ORF2表达。进一步分析发现,PCV2感染过表达PSMB2的PK15细胞,促进IκBα的降解和p65的核转位,激活细胞内NF-κB信号通路,并调节IL-6、IL-8和TNF-α等炎性因子的表达。NF-κB信号通路抑制剂BAY11-7082可抑制PSMB2对PCV2增殖的增强作用。结果表明PSMB2经由NF-κB信号通路调节PCV2的复制。总而言之,泛素蛋白酶体途径通过介导细胞周期进程调节PCV2的早期复制,并通过细胞内蛋白质的泛素化参与PCV2感染进程。进一步分析发现过表达PSME1的PK15细胞在PCV2感染后,细胞炎性因子表达失调,可能与PCV2涉及的免疫逃逸相关；PSMB2经由NF-κB信号通路调节PCV2的复制,并调节下游细胞因子的表达。