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甘草次酸是一种来源于甘草的五环三萜化合物,因其具有多种药理活性而受到广泛青睐,但是其水溶性差、生物利用度低以及临床上长期服用会引起多种毒副作用等缺陷限制了甘草次酸的进一步应用。为此,以甘草次酸为前体开发低毒性、高药效的新型甘草次酸衍生物类药物的策略受到广泛关注,其中糖基化修饰作为一种重要的天然产物改性的途径有着很多重要的应用。鉴于化学法实现甘草次酸糖基化修饰存在复杂的基团保护/脱保护过程、工艺复杂和产率低等问题,酶法因其定向性好,条件温和以及环境友好等优点而备受瞩目。课题组前期利用糖基转移酶BvEc体外催化实现了3-O-单葡萄糖基甘草次酸的生物合成,但是糖基转移酶BvEc依赖于昂贵的UDP-葡萄糖作为糖基供体,而且糖基转移酶催化效率低并且糖基化产物较为单一,这些因素限制了糖基转移酶的进一步应用。本研究通过对甘草中的蔗糖合酶进行系统分析与挖掘,并且构建了偶联甘草蔗糖合酶的UDP循环再生体系,从而实现酶法合成多种甘草次酸糖基化衍生物,为甘草次酸糖基化修饰的相关研究提供新思路。主要研究结果如下:(1)通过对乌拉尔甘草基因组信息进行系统分析和挖掘,成功克隆得到2个甘草蔗糖合酶基因:Gu Su S1和Gu Su S2,并通过原核表达,体外验证了二者具备合成蔗糖以及水解蔗糖的活性,同时分析了Gu Su S1和Gu Su S2系统进化关系。对Gu Su S1和Gu Su S2重组蛋白进行了纯化并确定了Gu Su S1和Gu Su S2催化蔗糖水解反应的最适p H均为5.5,最适温度均为50℃。此外,还对Gu Su S1和Gu Su S2的酶学特性进行了表征,通过对Gu Su S1进行三维结构的同源模拟以及与底物蔗糖和UDP分子进行对接分析,确定了13个潜在关键氨基酸位点,并结合丙氨酸突变扫描实验发现其中7个位点对于Gu Su S1催化蔗糖水解过程十分重要,初步探究了其反应机理。(2)偶联蔗糖合酶Gu Su S1和糖基转移酶BvEc构建UDP循环再生系统,并通过该系统得到3-O-单葡萄糖基甘草次酸以及另外两种新型甘草次酸糖基化衍生物。通过反应条件的优化,确定了该系统最适反应温度为40℃,最适p H为6.5,发现Gu Su S1与BvEc的添加比例从1:1直至1:5时整体反应效率未受影响,且使用乙醇或DMSO作为助溶剂对于该系统亦无影响。通过半制备液相色谱制备获得两种甘草次酸糖基化衍生物的纯品,结合LC-MS与NMR分析确定了两种化合物的结构,分别为30-O-单葡萄糖基-3-O-单葡萄糖基甘草次酸和30-O-单葡萄糖基-3-O-单葡萄糖醛酸基甘草次酸,经过数据库检索,确定30-O-单葡萄糖基-3-O-单葡萄糖醛酸基甘草次酸为首次合成发现。通过Time-course实验发现运用UDP循环再生系统可以5h内将甘草次酸全部转化完毕,30-O-单葡萄糖基-3-O-单葡萄糖基甘草次酸占比达到70.84%,而3-O-单葡萄糖基甘草次酸占到了34.33%,与直接外源添加UDP-葡萄糖相比不仅可以大大提高甘草次酸糖基化的效率,更释放了糖基转移酶BvEc的催化潜力。