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β-葡萄糖醛酸苷酶（GUS）被广泛应用于天然葡萄糖醛酸苷类化合物的修饰,以提高其活性和生物利用度。课题组前期发现来源于米曲酶（Aspergillus terreus Li-3）的GH2家族的β-葡萄糖醛酸苷酶（PGUS）,可以水解天然底物甘草酸（Glycyrrhizin,GL）转化为价值更高的甘草次酸（Glycyrrhetinic acid,GA）。但该酶的热稳定性和活性较差,且催化GL的机理尚不完全清楚,使得其工程化改造和工业应用受限。本文通过结构分析和计算机模拟相结合的方法,发现了对PGUS稳定性和活性有影响的关键loop,理性设计截除PGUS的C-末端loop提高其催化能力,并探究了Floop和loop470在PGUS水解GL中的关键作用。主要研究结果如下:（1）通过结合对PGUS的结构（B-factor）和分子动力学模拟（RMSF）分析的方法,准确地定位C-末端loop是造成PGUS不稳定的重要区域,据此设计了C-末端loop截除的突变体,其中D590-604和D591-504在70℃下的热稳定性提高了1.5倍,去折叠吉布斯自由能（ΔG）比PGUS(31.9 k J mol-1)增加了6.8 k J mol-1。同时,突变体的表达量也增加了77.1%,催化效率kcat/Km提高了1.6倍。通过PGUS与底物p NPG复合物的分子动力学模拟发现C-末端loop的截除改变了活性口袋的构象,缩小了催化氨基酸与底物之间的距离,促使催化效率的提高。建立分批补料反应工艺,实现PGUS突变体对GL的高效转化,D590-604和D591-504补料3次,GL转化率分别为83.6%和78.1%,相应GA的产率分别为96.1%和95.6%,而野生型PGUS只能补料1次,GL转化率仅为66.0%,GA产率为57.1%。（2）我们发现了C-末端loop对GH2家族的EGUS（来源于大肠杆菌的GUS）的表达和酶活性也有重要的调节作用。该loop的全截除（D588-603）导致目标蛋白的表达水平降低39.8%,比酶活降低49%,而部分截除（D597-603）突变体的可溶性表达水平增加了63.5%,研究结果表明EGUS的部分C-末端loop（D588-596）对于维持其表达水平和活性是必需的。结合文献已报道的GH2家族的HGUS（来源于人的GUS）的整个C-末端loop对其表达、活性和磷酸化程度均有重要作用,本文提出了GH2家族GUSs的C-末端loop的功能进化过程,由真菌到细菌再到哺乳动物。（3）通过PGUS与GL复合结构的200 ns分子动力学模拟,确定了Floop（残基362-377）和loop470（残基369-473）是PGUS底物通道的关键组成部分,其中Floop对于底物GL苷元部分的识别有重要作用,并且负责GL苷元在催化过程中的翻转;而loop470主要负责糖基的识别,通过在催化过程中的动态移动,引导GL构象和位置的调整进行催化水解。结合前期得到的PGUS与GAMG复合物的晶体结构,阐释了PGUS连续水解GL和GAMG到GA的分子机制。基于PGUS的底物识别特性,通过关键loop替换将EGUS水解GAMG的活性提高了4.6倍。