高压对果蝇的诱变及作用机理的研究

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高压是地球和海洋中生物圈存在的重要环境参数之一。海洋约占地球表面的70%,平均深度是3800米,平均压力是38.5 MPa。随着嗜压和嗜热微生物的相继发现,对高压和高温与生命起源关系的研究成为新的热点。果蝇作为模式生物的典型代表,它遗传背景研究的比较透彻,基因组测序已经完成,并且它的部分基因与高等生物有很高的同源性,所以研究高压对果蝇卵的作用机制为进一步探索高压在生命起源和生物进化等重大生命现象中的作用具有重要的意义。本文首次研究不同压力对果蝇的生长,发育,形态和生理性质等的影响,结果发现随着压力升高,果蝇存活率下降,当压力达到90 MPa时,存活率为零。高压还导致了果蝇雌雄比的增加和雌蝇产卵能力的增强。正常地,未经高压处理的对照果蝇的绒毛附属物完整有规则,而高压处理后的果蝇卵出现异常的表型,主要是绒毛附属物较短和畸型并且不规则地附在卵黄膜外面。未经高压处理过对照组果蝇的卵黄膜平整光滑,而经不同压力处理过的果蝇卵黄膜出现一层泡状或白色絮状物质,当压力强度增加到100 MPa时,卵黄膜表面会出现异常的突起。未经压力处理过对照果蝇的幼虫体型小,体色发白,压力处理过幸存下来的果蝇幼虫体型大,体色发红。与之对应,未经压力处理过对照果蝇的蛹体型小,体色浅褐色,压力处理过果蝇的蛹和对照相比体型大,体色发红。经高压处理过幸存下来的果蝇成蝇翅膀表型发生了明显的畸变,正常果蝇翅膀形状是卵圆型,翅膀长度约占腹部长度的两倍,每个翅膀有五个纵脉和两个横脉以及完整的翅膀边缘。经高压处理过的突变果蝇翅膀退化,尤其翅膀尺寸大小,形状,脉络纹理和翅膀轮廓边缘都发生了畸变,并且丧失了飞行能力。我们随机地从60 MPa压力,20 min处理组中筛选出几对翅膀突变果蝇,培养在丰富培养基中,这些突变体至少能稳定遗传四代。采用DNA测序方法,基因表达谱芯片技术和RT-PCR方法分析其突变机制。首先,我们采用DNA测序分析了和翅膀发育有关的两个主要基因vg,sd。DNA测序结果表明sd基因未发生突变,vg共有四例点突变和一个插入突变,第一个点突变是在外显子1的第四个核苷酸由T变成C的颠换,即密码子由CTC→TTC,它是一个同义突变。外显子3共有三例点突变:分别为第137和332位核苷酸存在同义突变,分别由G→A和T→C的颠换突变。而第96位核苷酸存在错义突变,由T→C的颠换突变,即密码子由TCG→CCG,这使得225位的丝氨酸(S)变为脯氨酸(P)。并且在vg基因第一和第二外显子之间即内含子2的增强子下游处发现一段17个核苷酸(5/-TAGCTGCATTAAATCTT-3/)插入序列,以上这些DNA序列改变可连续稳定遗传四代。其次,我们又从基因表达水平上研究高压对果蝇诱变机制,采用基因表达谱芯片去分析突变和对照体之间的全基因基因表达的差异性。结果发现翅膀突变果蝇与未处理对照果蝇相比两倍以上的差异表达基因总共有285个(P<0.05),119个上调和166个下调。为了验证芯片的数据准确性,我们采用RT-PCR方法进行了验证,我们随机选择两个和翅膀发育有关的基因测定它们的表达情况,RT-PCR实验结果和芯片实验结果方向相同,证明芯片的结果是可靠、正确的。我们使用GO term方法预测285个基因的功能。GO分为三个独立的类别,有细胞成分,分子功能和生物过程。这组差异表达基因中有203个富集在生物过程,149个富集在GO细胞成分,200个富集在GO分子功能。在翅膀突变果蝇中具有明显差异表达的分子功能GO分类包括结构分子活性,结合,催化活性,运输活性,转录调控激活,分子传感器活性。富集在GO term分析中,生物学过程里差异明显的有细胞过程,代谢过程,生物调节,多细胞有机体的细胞定位,生物过程调控,发育过程,定位的建立,对刺激的反应;富集在细胞成分里差异明显的有细胞外躯段,细胞,细胞部分,细胞器,细胞器部分,大分子复合物。由于细胞信号通路以不同的机制调控着诸多的生理过程,在细胞的增殖、分化,动物体的生长、发育中起着重要作用。我们实验结果证明压力能改变果蝇的很多信号通路,其中Wnt与Notch两个信号通路对果蝇翅膀发育有直接作用。Notch信号通路的改变是通过Numb基因下调表达来实现的,Wnt信号通路的改变是通过Rocla基因下调表达来实现的。这些基因序列,基因表达和信号通路的改变共同协调作用是造成果蝇表型畸变的原因。本文较系统地研究了高压对果蝇生长发育,生理性质,表型的影响为进一步研究生命起源与进化,高等生物的压力极限,地球和海洋内的生物的分布,以及在其它星系中寻索可能存在的生命有着重要的意义。
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