论文部分内容阅读
茄子（Solanum melongena L.）为茄科最重要蔬菜作物之一,在全国各地均有种植,据FAO统计,2019年我国茄子栽培面积为78.30万hm~2,占世界总栽培面积的42.37%。茄子杂种优势明显,种子杂交生产主要以人工去雄为主,费时费力成本较高,同时加之去雄时选择花蕾不当或去雄不彻底,很容易形成假杂种,降低种子的纯度和质量。如果利用雄性不育系作为母本进行大规模杂交种子生产,避免了人工去雄的需要,简化制种程序,又可降低成本,提高种子纯度,具有很好地应用前景,是茄子杂种优势利用最经济有效的途径。雄性不育（Male sterility）是指植物在有性繁殖过程中雄蕊无法正常生长和产生有活力花粉,而雌蕊能正常授粉受精的现象。功能性雄性不育作为雄性不育的一种,其可以产生正常有活力花粉,但由于花药不开裂,导致花粉不能在柱头上萌发,异常的花粉管阻碍花粉到达胚珠,无法完成授粉受精过程。近年来,我国关于茄子雄性不育系材料的选育已取得一些成就,但至今未大面积投入生产。功能雄性不育系因自身有可育花粉,无须再选育保持系,方便育种工作。另外,对茄子雄性不育机制的研究多集中在遗传、细胞和生理生化方面,分子机制方面的报道比较少。因此,研究茄子花药开裂的分子机制具有重要意义。本研究以茄子可育系F142为试材,以课题组前期转录组测序数据为基础,通过差异表达基因分析,发现Sm MYB108基因在茄子花蕾发育不同时期差异表达。因此以转录因子Sm MYB108为研究重点,采取多种研究方法和技术展开研究,分析其在花药发育中的作用和分子调控机制,从而为解析茄子花药开裂的分子调控机理奠定一定的基础。试验主要结果如下:1.通过对可育系F142花蕾发育三个时期（开花前8天、开花前5天和开花当天）的转录本进行比较分析,共得到5549个差异表达基因（DEGs）。其中,大多数DEGs集中在组合开花前8天vs开花当天（8DBF vs FD）、开花前5天vs开花当天（5DBF vs FD）中,有2562个基因为8DBF vs FD、5DBF vs FD共同的DEGs。筛选到89个编码转录因子的DEGs,其中包含11个MYB转录因子DEGs,并且Sm MYB108转录因子在开花当天显著上调。2.在F142花蕾中克隆得到了Sm MYB108基因。Sm MYB108含有高度保守的R2-R3 MYB结构域,属于典型的R2-R3型MYB转录因子。利用实时荧光定量PCR测定,Sm MYB108基因在茄子根、花中表达量较高,花药发育前期表达量低,而在成熟花药中表达量显著上调。亚细胞定位发现Sm MYB108蛋白属于核蛋白。3.将Sm MYB108基因的超表达载体p CAMBIA-2301G-Sm MYB108遗传转化本氏烟,共获得14株转基因烟草植株。与野生型烟草相比,转基因烟草的花器官无差异,花药正常开裂并释放有活力的花粉;通过比较同一时期花药开裂程度,转基因烟草花药开裂程度较大,推测转基因烟草花药开裂提前。4.拟南芥突变体myb108花丝变短,花药开裂延迟,花粉活力降低。将Sm MYB108基因的超表达载体p Bin35Sred3-Sm MYB108转入拟南芥突变体myb108中,利用载体所携带的红光筛选标记,进行转基因植株初筛,再通过PCR鉴定及RT-PCR鉴定阳性转基因植株,结果显示,阳性植株花药正常开裂并及时释放有活力的花粉,花丝变长,与野生型无差异。5.利用Y2H技术进行转录活性检测,发现Sm MYB108蛋白全长具有转录激活活性,通过保留保守结构域进行截短,发现Sm MYB108蛋白N端无转录激活活性,C端具有转录激活活性,C端137～317aa和262～317aa两个片段均有自激活活性,随着距C端距离的减小,将C端262～318aa片段再次拆分为43aa和13aa,结果距C端43aa和13aa两个片段自激活均减弱,说明Sm MYB108转录因子的自激活结构域遭到破坏。因此Sm MYB108转录因子自激活结构域位于C端的262～318aa处。6.克隆了序列长2000 bp的Sm MYB108的启动子,Plant CARE软件分析该启动子上含有多个转录因子结合位点。利用Y1H技术发现,Y1H（pr Sm MYB108+Sm ARF6）、Y1H（pr Sm MYB108+Sm ARF8）、Y1H（pr Sm MYB108+Sm MYB21）能在SD/-Leu/Ab A600上长出白色菌斑,Y1H（pr Sm MYB108+Sm MYB26）不能在SD/-Leu/Ab A600上长出白色菌斑,表明Sm ARF6、Sm ARF8和Sm MYB21可以结合到Sm MYB108启动子上,而Sm MYB26不能与Sm MYB108启动子结合。双荧光素酶系统试验得到的结果与Y1H试验一致。