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番茄DR8(Development Regulation 8)基因是一个与果实成熟相关的新基因,与拟南芥的生长素反应基因家族(Aux/IAA)具有很高的同源性。DR8基因作为一个生长素诱导表达的基因,其表达水平却受到乙烯的负调控和生长素的正调控,预示着该基因不仅对果实成熟过程具有重要的调控作用,并且可能和生长素与乙烯的相互作用密切相关。目前,DR8全长基因已构建到植物表达载体pGA643,通过农杆菌介导的基因转化方法将其转入番茄基因组中,获得了DR8超表达和抑制表达的转基因植株。为了深入阐明该基因的表达调控机制及其对乙烯、生长素的反应,十分必要分离DR8基因的启动子,分析并确定其激素调控区域及精确调控位点,为该基因的功能研究及启动子的应用奠定基础。本研究利用DNA步移PCR法进行启动子扩增,并从中设计构建了3个5端缺失片段的pGreen-GFP荧光表达载体,转化烟草原生质体,经2,4-D处理后的荧光表达分析发现在250 bp区域内存在1个生长素的正调控位点。另外,在本研究中还构建了7个pBI121植物表达载体,为.DR8基因启动子的番茄转化研究奠定了很好的基础主要研究结果如下:
①利用DNA步移PCR技术从番茄基因组DNA中分离了DR8基因的部分启动子,1031bp。
②启动子序列分析表明,启动子序列中含有大量AT丰富区域,TATA-box,CAAT-box,G-box,此区域为启动子的基本功能区,在该启动子序列中还存在其它调控区域,如ERE是乙烯响应元件,HSE是热激响应元件,3-AFl binding site是光响应元件,TCA-element是水杨酸响应元件。
③构建了3个5端缺失片段的pGreen-GFP荧光表达载体,其缺失片段大小分别为250 bp、500 bp、1031 bp。
④通过PEG法将荧光表达载体转化烟草原生质体,经2,4-D处理后发现启动子中存在生长素的正调控区域,位于3端250 bp范围内。
⑤构建了7个pBI121植物表达载体。