猪呼吸系统疾病综合征（Porcine Respiratory Disease Complex,PRDC）是一种由多种因素引起的综合症,给世界养猪业带来巨大的经济损失,其中涉及的主要病原因素包括细菌（如猪胸膜肺炎放线杆菌、猪支气管败血性波氏杆菌、多杀性巴氏杆菌和副猪革拉瑟氏杆菌）、病毒（如猪甲型流感病毒、猪繁殖与呼吸道综合征病毒和猪圆环病毒2型）和支原体（如猪支原体和猪肺炎支原体）。不同病原因素在PRDC发展中的作用和影响是复杂的,且病变的严重性是不同因素协同作用的结果。通常认为在PRDC发展过程中病毒性因素的致病机理主要是破坏呼吸道黏膜上皮纤毛结构和干扰肺泡巨噬细胞的功能,而细菌性因素的致病机理主要是刺激机体产生炎症反应。然而,目前对PRDC病原突破呼吸道屏障的分子机制尚不清楚。本研究以新生仔猪气管上皮细胞为体外模型,利用免疫印迹、免疫荧光、ECIS（Electric Cell-substrate Impedance Sensing）、Transwell等方法证明PRDC细菌性病原通过破坏气管上皮细胞屏障来促进自身的跨细胞迁移。同时,利用酪蛋白酶谱法和质谱鉴定了副猪革拉瑟氏杆菌（Glaesserella parasuis,GPS）中具有水解活性的蛋白酶。质谱结果结合氨基酸同源性分析表明PRDC细菌性病原中具有丝氨酸蛋白酶HtrA/DegQ,通过体外实验证实了丝氨酸蛋白酶HtrA/DegQ的生物学功能。最后,通过仔猪攻毒实验,揭示了丝氨酸蛋白酶HtrA/DegQ在PRDC细菌性病原突破宿主呼吸道上皮屏障和组织定殖中发挥着重要作用。论文的具体内容如下:1、PRDC病原菌在体内和体外破坏呼吸道上皮细胞屏障HE（Hematoxylin and Eosin）染色显示PRDC病原菌GPS能够破坏仔猪气管气管上皮层,表现为呼吸道纤毛丢失及上皮细胞。在体内,免疫荧光显示其可以破坏气管上皮的紧密连接蛋白ZO-1和黏附连接蛋白E-钙黏蛋白。在体外,通过免疫荧光和免疫印迹发现PRDC病原菌可以破坏NPTr细胞紧密连接和黏附连接蛋白,且能使E-钙黏蛋白胞外域释放到细胞上清中。同时,ECIS显示PRDC病原菌能够降低NPTr单层细胞的跨细胞电阻。2、E-钙黏蛋白维持上皮细胞屏障功能以及影响PRDC病原菌的跨细胞迁移利用CRISPR/Cas9基因编辑技术在NPTr细胞中构建E-钙黏蛋白的缺失细胞系。PCR、免疫印迹和荧光定量PCR显示E-钙黏蛋白的成功敲除。通过ECIS检测发现E-钙黏蛋白能维持NPTr单层细胞的跨细胞电阻。通过PRDC病原菌对野生型或E-钙黏蛋白敲除型的NPTr细胞的黏附、侵入以及跨细胞迁移实验,我们发现E-钙黏蛋白影响PRDC病原菌的跨细胞迁移。通过核质分离实验和荧光定量PCR证实E-钙黏蛋白的敲除影响β-catenin在细胞核中的分布以及趋化因子的表达。3、E-钙黏蛋白的切割不依赖宿主基质金属蛋白酶为了分析在PRDC病原菌感染过程中E-钙黏蛋白胞外域释放到细胞上清中具体机制,我们用基质金属蛋白酶广谱抑制剂处理NPTr细胞后进行PRDC病原菌感染,免疫印迹检测发现E-钙黏蛋白全长蛋白的减少并未得到恢复。同时,我们用免疫印迹检测PRDC病原菌感染后基质金属蛋白酶MMP7和ADAM10的变化,免疫印迹显示在感染后MMP7蛋白水平下降,而ADAM10无变化。为排除ADAM10在感染中对E-钙黏蛋白的切割作用,我们用siRNA或者特异性抑制剂降低ADAM10蛋白水平后进行PRDC病原菌感染,通过免疫印迹发现ADAM10不参与PRDC病原感染过程中E-钙黏蛋白降低作用。与此同时,我们用明胶酶谱实验证实PRDC病原菌感染NPTr细胞并不能增强细胞的基质金属蛋白酶的活性。4、筛选PRDC病原菌中的潜在具有水解活性的蛋白酶为进一步探索PRDC病原菌参与E-钙黏蛋白的胞外域释放的因素,我们用酪蛋白酶谱结合质谱鉴定技术,筛选到GPS中具有水解活性的丝氨酸蛋白酶HtrA。多序列比对和结构预测表明,所有PRDC病原菌中均具有与HtrA蛋白同源的DegQ丝氨酸蛋白酶。为进一步探索HtrA/DegQ丝氨酸蛋白酶的活性,我们克隆和纯化PRDC病原菌的野生型或者活性中心的丝氨酸位点突变型（丝氨酸突变成丙氨酸）的HtrA/DegQ丝氨酸蛋白酶。酪蛋白酶谱表明野生型的HtrA/DegQ蛋白具有酪蛋白水解活性,而丝氨酸位点突变型却没有活性。免疫印迹显示HtrA/DegQ丝氨酸蛋白酶能够降解重组的猪源的E-钙黏蛋白的胞外域。通过HtrA多克隆抗体的制备,我们用免疫印迹证实GPS的丝氨酸蛋白酶HtrA可以分泌到胞外,并且可以切割NPTr细胞的E-钙黏蛋白。最终,ECIS显示PRDC病原菌的HtrA/DegQ丝氨酸蛋白酶影响NPTr单层细胞的跨细胞电阻。5、htrA基因缺失影响GPS在仔猪体内的定殖首先,通过自然转化的方法,我们在PRDC病原菌GPS中构建了htrA基因缺失菌株。PCR、免疫印迹和荧光定量PCR表明htrA基因成功缺失。在体外,免疫荧光、免疫印迹、黏附实验和Transwell实验证实htrA基因缺失影响GPS对E-钙黏蛋白的切割和跨细胞迁移。在体内,HE染色、组织分菌、免疫组化和免疫荧光显示htrA基因影响GPS对呼吸道组织的病理损伤、气管E-钙黏蛋白的破坏、跨呼吸道上皮细胞屏障的能力及在呼吸道以外的组织中定殖的能力。6、具有ATPase活性的蛋白酶ClpX调控HtrA的蛋白水平酪蛋白酶谱分析和质谱分析结果表明,蛋白酶ClpX直接或间接参与酪蛋白的水解。通过多序列比对和ATP水解实验,发现ClpX是一种具有ATPase活性的蛋白酶。为了更详细地了解ClpX活性,我们克隆并纯化了GPS的野生型（WT）ClpX,并通过在Walker B结构域中将谷氨酸突变为丙氨酸（EA）表达相应的无活性的突变体。ATP和酪蛋白水解实验表明ClpX蛋白不具有酪蛋白水解活性。通过构建clp X基因缺失菌株以及在htrA基因缺失菌株中表达ClpX蛋白,我们发现不是ClpX蛋白直接降解酪蛋白,而是clp X缺失影响总的和分泌的HtrA蛋白。同样地,我们用clp X基因缺失菌株感染NPTr细胞,免疫印迹结果显示clpX缺失后影响E-钙黏蛋白的切割。