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目的利用二代高通量测序技术，进行掌叶大黄转录组测序并进行数据分析，筛选出蒽醌类合成的关键酶基因，为研究掌叶大黄蒽醌合成与积累的分子表达调控机制提供理论依据。
方法首先，采用高效液相色谱法对一年生掌叶大黄根、根茎及叶三个组织部位中10种活性成分进行含量测定。其次，采集一年生新鲜掌叶大黄根、根茎、叶组织，分别提取各组织总RNA，建立cDNA文库，进行IlluminaHiSeqTM2000150PE高通量测序。测序得到的原始序列进行质量控制得到cleanreads，采用Trinity进行组装获得unigenes。Unigenes的BLAST分析包括与Nr、Nt、Pfam、KOG/COG、Swiss-prot、KEGG、GO七大数据库的基因功能注释；根据代谢通路（KEGGpathway）注释的KEGGID查找参与蒽醌类合成的代谢途径关键酶基因。运用qPCR验证关键酶基因表达。RT-PCR克隆部分关键酶基因进行生物信息和表达分析。
结果大黄10种特征性成分大黄酸、大黄酚、大黄素、芦荟大黄素、大黄素甲醚、大黄酚-8-O-葡萄糖苷、大黄素-8-O-葡萄糖苷、番泻苷B、儿茶素、没食子酸，除儿茶素外，其它成分在一年生掌叶大黄不同部位中含量均为根＞根茎＞叶，说明不同组织部位各活性成分含量存在差异。掌叶大黄转录组测序共得到28.04Gbcleanreads，186,942,208条高质量reads，Trinity组装成140,224个unigenes，平均长度1,235nt。基因功能注释表明共有140,224条unigenes在NR、NT、KO、Swiss-prot、PFAM、GO、KOG数据库得到注释，其中在KO、GO和KOG数据库注释成功的Unigene分别有39,641、71,152、28,603个，分别占总Gene数的28.26%、50.74%、20.39%。GO注释成功的基因可分为生物过程（Biologicalprocess）、细胞组分（Cellularcomponent）和分子功能（Molecularfunction）三大类57个分支。KEGG注释发现次生代谢的标准通路39个；RNA-seq质量评估表明根和根茎组织样品间的表达模式相似度最高，样品间差异基因较少。以qvalue＜0.005且|log2FoldChange|＞1为差异基因筛选条件，LvsR、RvsRH、LvsRH差异基因总个数分别为4,175个、992个、4,469个。GO富集分析发现注释到生物学过程、细胞成分、分子功能三种基本分类下的子term中，LvsR，RvsRH，LvsRH上调表达的差异基因分别为4,893个、862个、5,982个，下调表达的差异基因分别为1,486个、57个、13,764个。KEGG富集表明LvsR和LvsRH富集到Ribosome通路上的差异表达基因个数最多。结合文献分析发现蒽醌类物质合成的代谢通路MVA、MEP、莽草酸及聚酮途径，鉴定参与蒽醌类物质合成的关键酶基因113个，编码19种关键酶即DXPS、DXPR、ISPD、ISPE、ISPF、HDS、PKS、PKC、AACT、HMGS、MVK、PMK、DHQS、SDH、SMK、CS、IS/MenF、MenE、MenB。qPCR分析基因表达量，发现编码AACT、MCT、SDH、NAC关键酶和MYB转录因子的基因在根和根茎中的表达量比在叶中的高。12个差异表达基因实时定量PCR验证结果发现，11个差异表达基因在根、根茎和叶中的表达趋势与测序结果高度一致，只有1个不一致，验证了转录组测序数据的可靠性。运用RT-PCR从掌叶大黄中克隆DXPS和AACT基因，生物信息学分析发现DXPS和AACT均为稳定的亲水性蛋白，且都定位在细胞质上的可能性较大，进化树分析发现DXPS和AACT都与藜科植物甜菜、藜麦、菠菜DXPS和AACT蛋白亲缘关系最近，聚成一小分支。qPCR结果表明，DXPS基因在一年生掌叶大黄叶中表达量较高，根中次之，AACT在根中表达量较高，根茎中次之。
结论1.首次利用二代高通量测序技术完成了掌叶大黄根、根茎、叶组织部位的转录组测序，获得大量与转录调控、信号转导、次生代谢物合成等相关的关键基因，为掌叶大黄道地性形成遗传机理奠定基础。
2.RNA-seq比较不同部位基因表达谱，根与根茎蒽醌类合成代谢关键酶及转录因子基因表达量较高，证明了药用部位蒽醌类合成活跃。
3.PCR克隆获得MEP途径的DXPS基因、MVA途径的AACT基因，并初步进行生物信息学分析及表达分析，为蒽醌类物质生物合成的表达调控及功能研究提供基础。
方法首先，采用高效液相色谱法对一年生掌叶大黄根、根茎及叶三个组织部位中10种活性成分进行含量测定。其次，采集一年生新鲜掌叶大黄根、根茎、叶组织，分别提取各组织总RNA，建立cDNA文库，进行IlluminaHiSeqTM2000150PE高通量测序。测序得到的原始序列进行质量控制得到cleanreads，采用Trinity进行组装获得unigenes。Unigenes的BLAST分析包括与Nr、Nt、Pfam、KOG/COG、Swiss-prot、KEGG、GO七大数据库的基因功能注释；根据代谢通路（KEGGpathway）注释的KEGGID查找参与蒽醌类合成的代谢途径关键酶基因。运用qPCR验证关键酶基因表达。RT-PCR克隆部分关键酶基因进行生物信息和表达分析。
结果大黄10种特征性成分大黄酸、大黄酚、大黄素、芦荟大黄素、大黄素甲醚、大黄酚-8-O-葡萄糖苷、大黄素-8-O-葡萄糖苷、番泻苷B、儿茶素、没食子酸，除儿茶素外，其它成分在一年生掌叶大黄不同部位中含量均为根＞根茎＞叶，说明不同组织部位各活性成分含量存在差异。掌叶大黄转录组测序共得到28.04Gbcleanreads，186,942,208条高质量reads，Trinity组装成140,224个unigenes，平均长度1,235nt。基因功能注释表明共有140,224条unigenes在NR、NT、KO、Swiss-prot、PFAM、GO、KOG数据库得到注释，其中在KO、GO和KOG数据库注释成功的Unigene分别有39,641、71,152、28,603个，分别占总Gene数的28.26%、50.74%、20.39%。GO注释成功的基因可分为生物过程（Biologicalprocess）、细胞组分（Cellularcomponent）和分子功能（Molecularfunction）三大类57个分支。KEGG注释发现次生代谢的标准通路39个；RNA-seq质量评估表明根和根茎组织样品间的表达模式相似度最高，样品间差异基因较少。以qvalue＜0.005且|log2FoldChange|＞1为差异基因筛选条件，LvsR、RvsRH、LvsRH差异基因总个数分别为4,175个、992个、4,469个。GO富集分析发现注释到生物学过程、细胞成分、分子功能三种基本分类下的子term中，LvsR，RvsRH，LvsRH上调表达的差异基因分别为4,893个、862个、5,982个，下调表达的差异基因分别为1,486个、57个、13,764个。KEGG富集表明LvsR和LvsRH富集到Ribosome通路上的差异表达基因个数最多。结合文献分析发现蒽醌类物质合成的代谢通路MVA、MEP、莽草酸及聚酮途径，鉴定参与蒽醌类物质合成的关键酶基因113个，编码19种关键酶即DXPS、DXPR、ISPD、ISPE、ISPF、HDS、PKS、PKC、AACT、HMGS、MVK、PMK、DHQS、SDH、SMK、CS、IS/MenF、MenE、MenB。qPCR分析基因表达量，发现编码AACT、MCT、SDH、NAC关键酶和MYB转录因子的基因在根和根茎中的表达量比在叶中的高。12个差异表达基因实时定量PCR验证结果发现，11个差异表达基因在根、根茎和叶中的表达趋势与测序结果高度一致，只有1个不一致，验证了转录组测序数据的可靠性。运用RT-PCR从掌叶大黄中克隆DXPS和AACT基因，生物信息学分析发现DXPS和AACT均为稳定的亲水性蛋白，且都定位在细胞质上的可能性较大，进化树分析发现DXPS和AACT都与藜科植物甜菜、藜麦、菠菜DXPS和AACT蛋白亲缘关系最近，聚成一小分支。qPCR结果表明，DXPS基因在一年生掌叶大黄叶中表达量较高，根中次之，AACT在根中表达量较高，根茎中次之。
结论1.首次利用二代高通量测序技术完成了掌叶大黄根、根茎、叶组织部位的转录组测序，获得大量与转录调控、信号转导、次生代谢物合成等相关的关键基因，为掌叶大黄道地性形成遗传机理奠定基础。
2.RNA-seq比较不同部位基因表达谱，根与根茎蒽醌类合成代谢关键酶及转录因子基因表达量较高，证明了药用部位蒽醌类合成活跃。
3.PCR克隆获得MEP途径的DXPS基因、MVA途径的AACT基因，并初步进行生物信息学分析及表达分析，为蒽醌类物质生物合成的表达调控及功能研究提供基础。