铁是生物体所必需的微量元素,它作为辅助因子参与了一系列重要的生物学过程。比如氨基酸代谢,细胞呼吸以及甾醇和DNA的生物合成。由于人体中的铁多以铁蛋白、转铁蛋白及乳铁蛋白的形式存在,因此病原菌在宿主体内可以利用的自由铁离子浓度很低。因而,微生物能够从宿主体内成功的获取铁是其成为病原菌的关键。烟曲霉是由空气传播的重要条件致病真菌,能够导致免疫缺陷病人患侵袭性曲霉病。在烟曲霉中,铁离子的平衡受到严格的调控。主要有两个关键的转录因子参与其中,分别是HapX和SreA。研究表明hapX和sreA是通过相互抑制来维持细胞内铁离子的平衡。当环境中铁离子浓度降低时,hapX表达量升高,通过抑制铁的消耗途径以及抑制sreA的表达,促进铁吸收相关基因的表达。相反,当环境中的铁离子处于较高浓度时,sreA的表达量会上调,一方面抑制hapX的表达,解除其对铁离子消耗途径的抑制从而促进铁离子的消耗,另一方面其能与特异性的ATCWGATAA序列结合,从而抑制与铁离子吸收相关的基因的表达。为了寻找烟曲霉中新的铁吸收相关基因,我们对T-DNA插入突变体库(大约2000个转化子)进行了筛选,发现第421号菌株(命名为H0421)在低铁条件下表现出敏感表型。通过TAIL-PCR分析表明tpcA基因受到破坏。该基因在曲霉中没有研究,在酵母中的同源基因功能是编码线粒体内膜上的转运蛋白,将细胞基质内的辅酶硫胺素焦磷酸(ThPP)跨膜转运至线粒体内并将硫胺素单磷酸(ThMP)交换运出。该基因定点敲除后,突变菌株表型和T-DNA插入突变体表型一致,并且tpcA基因能回补H0421菌株低铁敏感表型。表明我们已经成功筛选到了一个低铁条件下发挥作用的基因。TpcA功能研究主要实验结果如下:(1)通过C端标记GFP绿色荧光蛋白,我们检测到TpcA蛋白是定位在线粒体内膜,这是与酵母中报道是相一致的。(2)ΔtpcA是硫胺素的营养缺陷型菌株,酵母中的同源基因tpc1可以恢复ΔtpcA菌株的硫胺素营养缺陷表型。(3)通过对六个保守氨基酸位点进行定点突变,发现G153S、D60A、K255A和K315A点突变菌株相对于野生型菌丝生长延迟和菌落无性产孢量大大减少,外源添加硫胺素能恢复因位点突变引起的菌落生长缺陷。另外,K255A/K315A双突变菌株在基础培养基上与敲除表型一致,几乎不生长表现为硫胺素的营养缺陷型。因此,G153、D60、K255和K315四个位点对转运ThPP有重要影响。(4)低铁条件下TpcA的缺失不影响铁调控相关基因的表达但使铁载体TAFC产量相对于野生型下降了 30%。综上所述,本文首次在烟曲霉中证实TpcA不仅具有转运辅酶ThPP进入线粒体的功能,同时还参与了铁离子的吸收。TpcA的缺失会降低铁载体产生从而使TpcA缺失菌株在应对低铁环境时,无法有效的借助铁载体来介导对铁的吸收,导致生长缺陷。该基因在低铁下是如何影响铁载体产量的以及与毒力的关系还需要进一步探究。