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研究背景21世纪以来,糖尿病发病率在世界范围内急速升高,目前已成为人类健康的重大威胁。糖尿病患者中,约90%以上为以胰岛素抵抗为特征的2型糖尿病。而与2型糖尿病伴随发展的并发症,特别是心血管并发症,已成为糖尿病致死的重要组成原因。血管内皮功能障碍是以NO生物活性减少为主要特征的病理改变,在体条件下往往表现为内皮依赖性的血管舒张功能降低。内皮功能障碍作为动脉粥样硬化的始动因素在2型糖尿病发生发展过程中发挥关键作用。然而目前改善内皮损伤的有效治疗措施十分有限,相应的临床应用也未取得令人满意的进展。因此,阐明血管内皮功能障碍参与2型糖尿病发生发展的潜在分子机制并找寻相应的治疗靶点对于糖尿病心血管并发症患者意义重大。T-cadherin(T-cad)是钙粘蛋白(cadherin)家族成员中的一员,但与其他家族成员不同的是,T-cad位于细胞表面的胞内结构域缺失。T-cad全身表达含量最高的部位是血管组织。大量研究表明,T-cad在调节内皮细胞功能方面发挥重要作用。值得注意的是,近期有研究指出在2型糖尿病发展早期,T-cad表达水平在粥样硬化斑块局部出现明显升高。此外,亦有针对2型糖尿病的临床研究证实,T-cad表达水平与2型糖尿病发病率之间存在相关性。然而迄今为止,学术界对于T-cad在糖尿病血管并发症中所发挥的作用仍知之甚少。相关研究报道也十分有限,而针对大体动物的功能性研究更是几乎为零。因此,本研究在我们实验室的既往研究基础上,成功构建小鼠2型糖尿病模型,并拟通过在体及离体实验研究探讨T-cad在糖尿病血管内皮损伤中发挥的作用及其机制。研究目的1.明确T-cad表达对野生小鼠及2型糖尿病小鼠血管损伤与内皮功能障碍的作用2.探索研究T-cad表达下调介导的血管内皮功能障碍的发生机制研究方法1.为构建小鼠2型糖尿病模型,我们采用进口的高脂饲料,将8周龄雄性C57BL/6j小鼠随机分为两组,一组为正常饮食对照(normal diet,ND)组,另一组为高脂饮食(high-fat diet,HFD)喂养组。ND组使用普通饲料(10%kcal脂肪)饲喂,HFD组使用高脂饲料(60%kcal)饲喂,饮水不做限制,持续喂养8周。每周监测体重及空腹血糖水平,8周时检测空腹血清胰岛素,空腹血清甘油三酯,总胆固醇及HOMA-IR指数,作为小鼠2型糖尿病造模成功指标。2.为检测糖尿病小鼠是否存在T-cad表达含量异常,我们分离造模成功的ND组野生小鼠与HFD组野生小鼠的血管组织,用Western Blot(WB)法及实时定量PCR(q RT-PCR)法检测血管组织T-cadherin表达水平。3.为直接观察T-cad表达变化对小鼠血管舒张功能的影响,我们分离T-cad KO小鼠与野生小鼠的降主动脉,之后再加工成血管环。我们将得到的两组血管环随机分为两组:乙酰胆碱(内皮依赖性血管舒张剂)处理组与酸化亚硝酸钠(内皮非依赖型血管舒张剂)处理组,使用DMT多通道成像系统检测分析血管环舒张功能。4.为直接观察高糖高脂环境下,T-cad表达变化对小鼠血管舒张功能的进一步影响,我们分离T-cad KO小鼠与野生小鼠的降主动脉,之后再加工成血管环。我们使用配制好的高糖高脂工作液干预血管环(HG,终浓度25.5 mmol/l;HF,终浓度300μmol/l),将血管环随机分为两组:T-cad KO+HGHF与WT+HGHF组,使用DMT多通道成像系统检测分析血管环舒张功能。5.为进一步证实T-cad表达变化对2型糖尿病小鼠血管舒张功能的影响,我们使用高脂饲料饲喂T-cad KO小鼠与野生小鼠8周,之后分离两组小鼠的降主动脉,加工成血管环,分为T-cad KO+HFD 8w与WT+HFD 8w组,使用DMT多通道成像系统检测分析血管环舒张功能。6.为进一步研究T-cad表达下调对小鼠血管舒张功能影响的潜在机制,我们分离T-cad KO小鼠与野生小鼠的血管组织,然后使用还原剂将血管组织中的硝酸盐还原成NO,再使用可以精确检测NO气体的分析系统(SIEVERS 280)检测血管组织NO的累积生成总量。7.为证实T-cad表达下调通过降低NO生成影响血管舒张功能,我们收集刚做完血管环实验的实验池液体,加入还原剂后直接使用可以精确检测NO气体的分析系统(SIEVERS 280)检测其中的NO含量。8.为确定血管组织NO生成减少的分子机制,我们分离提取了T-cad KO小鼠与野生小鼠的血管组织蛋白,然后使用Western Blot技术检测两组小鼠血管组织中的p-Akt/Akt,与p-e NOS/e NOS蛋白水平。9.为验证Akt抑制剂的有效性,我们培养了人脐静脉内皮细胞(Human umbilical vein endothelial cells,HUVECs),然后将细胞随机分为正常对照组和Akt抑制剂处理组(Akt抑制剂处理细胞24小时),并使用Western Blot技术检测细胞的p-Akt与Akt表达水平。10.为进一步明确T-cad表达下调导致NO生成降低的潜在原因,在之前实验的基础上,我们培养了HUVECs,并将细胞随机分为正常对照组与Akt抑制剂处理组,再使用Caspase-3活性检测试剂盒检测各组细胞的凋亡水平。11.为进一步明确T-cad表达下调通过降低NO生物活性导致小鼠血管舒张功能下降的潜在机制,我们分离提取了T-cad KO小鼠与野生小鼠的血管组织蛋白,然后使用ELISA法检测两组血管蛋白的硝基酪氨酸含量。12.为获得支持T-cad表达下调通过增加NO失活导致小鼠血管舒张功能下降的进一步证据,我们分离了T-cad KO小鼠与野生小鼠的血管组织,并使用超氧化物分析仪检测两组血管组织超氧化物生成总量。研究结果1.高脂饮食饲喂8周龄雄性C57BL/6j小鼠8周后,相较于正常饮食喂养组,高脂饮食喂养组小鼠的平均体重显著增加(P<0.01),平均空腹血糖显著升高(P<0.01),平均空腹血清胰岛素水平显著升高(P<0.01),平均血清甘油三酯水平(P<0.05)与总胆固醇水平显著升高(P<0.01),HOMA-IR指数也显著提高(P<0.01),表明高脂饮食饲喂8周成功制备小鼠2型糖尿病模型。2.高脂饮食饲喂8周后,相比ND组,HFD组小鼠血管组织中T-cad的蛋白水平明显降低(P<0.01),同时m RNA水平与蛋白表达变化趋势一致,但并无统计学差异(P>0.05)。3.在正常对照小鼠组中,乙酰胆碱与酸化亚硝酸钠诱导的血管环舒张程度相当,无统计学差异(P>0.05)。而在T-cad KO小鼠的血管环中,相较于酸化亚硝酸钠处理而言,乙酰胆碱处理导致的浓度依赖性血管舒张则明显降低(P<0.05)。4.体外高糖高脂干预处理WT和T-cad KO两组小鼠主动脉环2.5小时后,发现两组主动脉环舒张功能均受到不同程度的损伤。然而与WT组相比,T-cad KO组血管的浓度依赖性舒张受损更为严重,具有明显的统计学差异(P<0.01)。5.使用高脂饮食持续饲喂WT小鼠和T-cad KO小鼠共8周。发现WT和T-cad KO两组小鼠的血管环舒张程度均出现不同程度的减少。然而相比正常饮食喂养组,HFD喂养组小鼠血管的浓度依赖性舒张受损更为严重,具有明显的统计学差异(P<0.01)。6.使用还原剂将血管组织中的硝酸盐还原为NO后,相较WT组,T-cad KO组小鼠血管组织的NO积累总量与NOx的生成量均出现明显降低,两项指标的差异均具有明显的统计学意义(P<0.05),提示T-cad表达下调导致NO生成减少。7.相较WT组而言,T-cad KO组小鼠血管组织的p-Akt蛋白水平明显下降,Akt蛋白水平无明显变化,p-e NOS及e NOS蛋白水平均轻微增高,但并无统计学差异(P>0.05)。综合而言,与WT组对比,T-cad KO组血管组织的p-Akt与Akt的比值明显降低,具有明显的统计学差异(P<0.05),但p-e NOS与e NOS的比值并无明显变化,两组间没有统计学差异(P>0.05)。8.与对照组相比,经Akt抑制剂处理的人脐静脉内皮细胞的Akt磷酸化水平明显降低(P<0.01)并伴随细胞Caspase-3活性明显升高(P<0.05),提示Akt活性被抑制后,内皮细胞凋亡水平明显增加。9.与WT组对比,T-cad KO组小鼠血管组织的超氧化物含量与硝基酪氨酸水平均显著增加,两项指标的差异均具有明显的统计学意义(P<0.05),提示T-cad表达下调导致NO失活加剧。结论1.使用高脂饮食饲喂小鼠8周成功制作小鼠2型糖尿病模型,同时观察到2型糖尿病条件下,小鼠血管组织T-cad出现表达下调。2.采用DMT多通道分析系统首次获得野生小鼠与2型糖尿病小鼠T-cad表达下调诱导血管内皮功能障碍的离体功能学证据。3.机制研究表明,以NO合成减少和NO失活加剧为特征的NO生物活性降低是T-cad表达下调导致血管内皮功能障碍的原因。综上所述,我们的研究不仅首次获得了生理条件或2型糖尿病条件下,小鼠T-cad表达下调诱导血管内皮功能障碍的离体功能学证据,同时部分阐明了其潜在的病理机制,而如何干预或治疗T-cad表达不足则很有可能成为临床上防治糖尿病血管损伤的潜在治疗靶点。