【摘 要】
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本文为了研究高致病性禽流感病毒的碱性聚合酶Ⅱ(PB2)在人体内的作用机制,并找出与之相互作的蛋白,应用了一系列的分子生物学方法对其进行研究,包括构建载体,表达蛋白,应用Stratag
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本文为了研究高致病性禽流感病毒的碱性聚合酶Ⅱ(PB2)在人体内的作用机制,并找出与之相互作的蛋白,应用了一系列的分子生物学方法对其进行研究,包括构建载体,表达蛋白,应用Stratagene公司的酵母双杂交系统筛选其相互作用蛋白。StratageneCytoTraD@XR(预制文库)系统为在体内检验蛋白质相互作用提供了一种新颖的方法。CytoTrap的酵母双杂交系统是以两个条件为基础,一是在酵母细胞之中发生相互作用并激活了Ras信号通路的融合蛋白们,二是这种相互作用是否发生与是否诱发细胞生长呈紧密关联。CytoTrap的优点在于能够帮助研究者们在不能用常规的双杂交或相互作用的诱捕系统时,研究蛋白质的相互作用。这些蛋白包括转录的启动子和终止子,需要在细胞之中作翻译后修饰的蛋白,以及那些在传统的双杂交系统中对酵母细胞产生毒性作用的蛋白。
在研究的过程中得到如下结果:成功构建了载体,并且在酵母细胞内获得表达;在酵母细胞内验证自激活反应,得出结论是:饵蛋白不能自身激活Ras信号通路,使突变型菌株在37℃生长,可以通过酵母双杂交进行相互作用蛋白的筛选;以CytoTrap@XR(预制文库)系统已经构建好的cDNA文库为靶蛋白载体,以构建好的PB2和Sos蛋白融合表达载体为饵蛋白载体,筛选与人肺细胞中的相互作用蛋白,结果是并未找到,即PB2在人肺细胞中并无相互作用蛋白存在。所以可以知道,流感病毒在人肺细胞内复制的过程中,流感病毒的三种聚合酶蛋白所形成的复合体与宿主体内的RNA聚合酶形成非共价键复合体时并不是依靠PB2蛋白与其结合,则有可能是PB1或者是PA发挥了这样的作用,为后续的研究奠定了基础。
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