东方巴贝斯虫(Babesia orientalis)是一种经镰形扇头蜱传播的重要血液原虫,是由本实验室发现并命名的一个巴贝斯虫新种,主要引起水牛巴贝斯虫病。该病在我国长江以南许多省份发生和流行,临床上患病牛以高热、贫血、黄疸和血红蛋白尿等为特征,甚至引起死亡,造成重大的经济损失。本研究首先利用本实验室构建的Babesia orientalis cDNA文库,进行了B.orientalis EST序列的测定和分析,并对所得的EST序列结果进行电子克隆延伸,针对EST的分析结果和延伸结果,选取线粒体基因进行克隆和测序,并进一步构建了细胞色素b基因的系统发育树。(1)B.orientalis EST序列的测定和分析从B.orientalis cDNA文库中随机挑取噬菌斑,转染Bm25.8,经PCR鉴定后将插入片段大于300 bp的阳性克隆子测序,共测定了1514条B.orientalis EST序列,对有效EST序列运用phrap等软件进行拼接,聚类后BLAST分析,得到1171个同源性较高的unigene,这些基因分别为:线粒体基因、RNA结合蛋白、类红细胞表面抗原、类裂殖体表面抗原、代谢相关的磷酸酶及蛋白酶、衰老相关蛋白、核糖体蛋白、热休克蛋白70、类热休克蛋白90、肌动蛋白、锌指蛋白、cGMP依赖蛋白激酶等基因的部分或全基因及功能未知的假定蛋白(hypotheticalprotein)基因部分或全基因;并且推测出共计5条可能的代谢途径,包括氧化磷酸化代谢途径、核糖体途径、细胞因子受体途径、细胞凋亡途径、抗体加工及呈递途径等多种代谢途径。(2)B.orientalis EST序列的电子克隆延伸和分析对所得的1514条EST序列逐条进行电子克隆延伸,其延伸长度由原来EST序列平均长度的593.7 bp延长至819 bp,延长了约1.4倍。83条可能的新基因中,与原虫具有同源性的基因数有15条,另外有69条EST序列与原虫有关,对其中51条进行了完全电子克隆的延伸。(3)B.orientalis线粒体基因的克隆、测序和生物信息学分析根据获得的EST序列分析结果和电子克隆分析结果,选取了转录丰度非常高的线粒体基因作进一步研究,其编号为Contig18,设计特异引物对这条候选序列各基因进行克隆和测序,只有少部分由于线粒体的自身特点无法测序得到,从而证实了电子克隆的有效性。同时还对线粒体上的各个基因做了分析,并对细胞色素b基因进行了系统发育分析,并结合原虫的18S系统发育树结果,对本实验室所发现的Babesia orientalis进行更精确的系统发育定位。本研究对东方巴贝斯虫EST序列的测序、电子克隆与分析,以及线粒体基因的测定,不仅加深了我们对东方巴贝斯虫分子水平上的理解,并且对进一步研究东方巴贝斯虫各个功能基因提供了基础和依据,为后期进一步研究东方巴贝斯虫线粒体各基因创造了条件。