【摘 要】
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目的:收集河北省2021年1月～11月发生的两次不同时期的本土新型冠状病毒肺炎（COVID-19）疫情（S市相关疫情和E市相关疫情）部分确诊病例的上呼吸道标本,对其进行新型冠状病毒（SARS-CoV-2）全基因组序列测定,获得SARS-CoV-2全基因组序列信息,通过核苷酸变异分析以及氨基酸变异分析,对病毒基因组变异特征进行综合阐释。方法:1.将病例上呼吸道标本充分混匀后提取病毒总RNA,通过新型
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目的:收集河北省2021年1月～11月发生的两次不同时期的本土新型冠状病毒肺炎（COVID-19）疫情（S市相关疫情和E市相关疫情）部分确诊病例的上呼吸道标本,对其进行新型冠状病毒（SARS-CoV-2）全基因组序列测定,获得SARS-CoV-2全基因组序列信息,通过核苷酸变异分析以及氨基酸变异分析,对病毒基因组变异特征进行综合阐释。方法:1.将病例上呼吸道标本充分混匀后提取病毒总RNA,通过新型冠状病毒核酸检测（荧光定量PCR法）确定各标本Ct值,并将Ct值符合基因组测序要求（Ct值≤33）的标本进行下一步测序。2.对获取的病毒总RNA进行反转录及全基因组扩增。3.得到扩增产物后,构建测序文库。4.将构建好的符合上机要求的文库加入到测序试剂夹盒中,上机进行高通量测序。5.测序完成后拷取下机序列文件,利用新型冠状病毒-Micro CoV?Analyer软件进行序列的组装拼接与分析。6.以SARS-CoV-2 Wuhan-Hu-1分离株（Gen Bank登录号:NC＿045512.2）基因组作为参考基因组序列,进行核苷酸变异分析以及氨基酸变异分析。结果:1.通过扩增子测序技术进行全基因组测序,共获得了202条近乎全长的SARS-CoV-2基因组序列（S市相关疫情134条、E市相关疫情68条）,相比Wuhan-Hu-1分离株基因组全长覆盖度为96.06%～100%。2.两次疫情相关SARS-CoV-2毒株均为L型分支。基于Pango分型法,S市相关疫情流行毒株属于B.1.1.330分支,E市相关疫情流行毒株属于AY.126（B.1.617.2.126）分支,即“Delta”变异株。3.S市相关疫情134条序列携带的核苷酸变异位点中位数为22个,范围为21～25个,在12个基因区域共发现64个SNP位点。按照核苷酸突变总数排序,排名前三的基因区域为ORF1a/b基因（35个）、S基因（10个）、ORF7a基因（4个）。共33个非同义突变,由于其中位于N蛋白的R203K的2个碱基突变共用同一密码子,故对应32个氨基酸变异,其中有20个涉及到氨基酸性质的改变。未发现插入或缺失突变。各个基因区域中变异频率最高的为ORF7a区（1.09%）。在S蛋白上发现了D614G等5个氨基酸突变。4.E市相关疫情68条序列携带的核苷酸变异位点中位数为46个,范围为44～48个,在10个基因区域共发现63个SNP位点。按照核苷酸突变总数排序,排名前三的基因区域为ORF1a/b基因（31个）、S基因（11个）、N基因（7个）。共48个非同义突变,其中涉及氨基酸性质改变的共有34个。此外还发现了109个核苷酸缺失突变,造成了相应36个氨基酸缺失。各个基因区域中变异频率最高的为ORF7a区（25.68%）。在S蛋白上发现D614G、L452R、T478K、P681R等10个氨基酸变异以及2个氨基酸缺失。5.两次新冠肺炎疫情相关全基因组序列核苷酸突变类型均以转换为主（S市相关78.13%;E市相关69.14%）,突变方向均以＞T为主（S市相关65.63%;E市相关55.56%）。6.对原始测序数据进行深度分析发现11个标本的基因组序列出现了15个不同比例的野生型-突变型杂合SNP位点。结论:1.两次新型冠状病毒肺炎疫情并非先前流行的本土疫情的持续传播,引起各起疫情的病毒毒株间不存在相关性。2.SARS-CoV-2在ORF1a/b、S、N以及ORF7a区域表现出更为活跃的基因变化。3.SARS-CoV-2基因组变异具有＞T突变的偏向性。4.两次疫情在S蛋白上均检出了部分已报道的可改变SARS-CoV-2生物学特性的氨基酸变异位点。5.基因组测序发现的野生型-突变型杂合SNP位点可在一定程度上说明,SARS-CoV-2变异可能首先发生在宿主体内,通过传播再在子代病例身上表现出来。
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