舌鳞状细胞癌(简称舌癌)是口腔颌面部最常见的恶性肿瘤，约占43.4％。传统的手术、放疗、化疗及其综合治疗对早期舌癌可获得良好的疗效，但对晚期或复发的患者疗效欠佳，其总的五年生存率不足60％。因此，有必要寻找新的诊断及治疗方法，以期提高舌癌患者的生存率和生存质量。 Cdc6(细胞分裂周期蛋白6)和Mcms(微小染色体维持蛋白)是目前研究较多的与人的恶性肿瘤关系最密切的两种DNA复制起始蛋白。Cdc6和Mcms都是真核生物DNA复制调控的重要因子，参与构成DNA复制前复合物。Cdc6的主要功能是在G1期向S期过渡中调节DNA复制的起始。真核生物细胞的Cdc6是ATP酶家族—AAA+ ATPases成员之一。作为细胞周期中DNA复制的能量代谢酶，具有促进ATP结合与水解的作用。这是人类染色体复制及通过S期所必需的。Cdc6另一功能是参与S—G2/M期检查点(check—point)的调控，协调细胞由S期向M期的进程，防止细胞在S期尚未完成DNA复制之前就进入有丝分裂M期。因此Cdc6是DNA复制和细胞增殖所必需的蛋白。Mcms蛋白家族有六个成员(Mcm2-7)，具解链酶的活性，同时在DNA复制的起始和延伸两个阶段起作用。 Cdc6和Mcms的表达都是在G1/S转换时达到高峰，但Cdc6是一个高度不稳定的蛋白质，半衰期短，其含量在细胞周期中是波动变化的，而Mcms蛋白却保持相对恒定。 Cdc6和Mcms主要在增殖活跃的细胞中表达，当细胞进入G0期和分化、衰老时不表达。这一特性在病理学诊断和鉴别诊断中具有重要意义并已应用于临床。 有研究表明，在宫颈癌、甲状腺癌、肺癌及脑肿瘤组织中存在高表达的Cdc6和Mcms，而且在某些癌症(如宫颈癌、膀胱癌)中Cdc6和Mcms标志比传统的PCNA和Ki—67要灵敏的多。在口腔鳞癌领域，Scott等研究认为Mcms在口腔鳞癌的早期诊断中是一种很有潜力的标志物，Szelachowska等研究提示Mcm2的表达水平可作为口腔鳞癌患者预后判断的一种方法。另外有研究指出，通过抑制Cdc6和Mcms等多种DNA复制起始蛋白的表达可选择性阻止肿瘤细胞的增殖，提示选择性抑制DNA复制起始蛋白的表达，有可能成为一种崭新而又有效的癌症治疗模式。 RNA干扰技术是近年来发现的一种新的诱导基因沉默的技术。当外源性或内源性双链RNA(dsRNA)进入细胞后，识别含有其互补序列的mRNA并与之结合，在酶的作用下特异性降解mRNA，从而干扰相应基因表达，导致基因沉默。RNAi效应具有高特异性、高稳定性、高效性，已成为肿瘤基因治疗研究的重要工具，并已广泛应用于口腔颌面部肿瘤基因治疗的研究。 基因治疗的关键是基因转移，即将外源基因(目的基因)特异转移至靶细胞并使之表达。目前进行基因转移的方法分为病毒载体系统和非病毒载体系统。非病毒载体系统(如显微注射、电穿孔、基因枪、脂质体介导等)的局限性是转移的效率太低，而病毒载体系统则克服了这个不足。最常用的病毒载体有慢病毒、逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒载体。其中以HIV-1为基础构建的慢病毒载体克服了逆转录病毒只能感染分裂期细胞的特点，同时又较腺病毒载体的免疫反应小，因而成为目前研究最多、最理想的基因转移载体之一。 第一部份 Cdc6和Mcm7在舌癌和癌前病变组织及舌癌细胞Tca8113中的表达 方法： 1、采用免疫组化和RT—PCR分别检测88例石蜡标本(舌癌54例，舌白斑34例)和37例冰冻标本(舌癌22例，舌白斑15例)中Cdc6和Mcm7蛋白与mRNA表达水平，并分析其表达与病理分级，临床分期及淋巴结转移等因素之间的相关性。 2、采用Real time RT—PCR和Western Blot检测人舌癌Tca8113细胞中Cdc6和Mcm7的mRNA和蛋白表达水平。 结果： 1、DNA复制起始蛋白Cdc6、Mcm7在正常口腔粘膜中不表达或者低表达，在癌前病变和舌癌组织中表达显著上调且表达量逐渐增强。Cdc6和Mcm7在舌癌Tca8113细胞中高表达。 2、Cdc6和Mcm7在有淋巴结转移组其阳性标记指数明显高于无转移组。 3、Cdc6和Mcm7的高表达与舌癌发生及淋巴结转移有相关性。 第二部分靶向Cdc6 RNA干扰质粒载体的构建与有效靶点的筛选 方法： 1、构建Cdc6 siRNA表达质粒：利用GenBank检索人Cdc6信息，以EASYTMsiRNA软件针对Cdc6设计5个靶点。经BLAST验证，制备双链DNAoligo，连接入双酶切的RNA干扰载体质粒pGCSIL—GFP，转化感受态细胞DH5α，挑取阳性克隆进行PCR鉴定与测序。 2、构建Cdc6真核过表达载体质粒：从cDNA文库中钓取目的基因Cdc6片段，将目的基因Cdc6片段与真核表达载体pEGFP—N1分别进行酶切并定向克隆连接，转化感受态细胞，挑取阳性克隆进行PCR鉴定与测序。 3、靶向Cdc6 RNA干扰有效靶点筛选：将前期构建好的目的基因Cdc6过表达载体质粒和针对不同靶点Cdc6 siRNA的表达载体质粒共转染293T细胞。采用Western blot检测Cdc6蛋白表达情况，判断不同靶点的干扰效果，选出最佳2条序列进入后续实验。 结果： 1、针对Cdc6设计的5条siRNA序列均100％命中靶序列，与Cdc6完全同源，特异性高；阴性对照序列不与任何已知基因转录子交叉同源。 2、成功构建靶向Cdc6 RNAi载体质粒：pGCSIL—GFP—Cdc6 shRNA。 3、成功构建Cdc6过表达载体质粒：pEGFP—N1-Cdc6。 4、经外源筛靶实验显示各实验组较NC组对Cdc6基因表达均能起到不同程度的敲减作用，其中Target3和Target4靶点对目的基因的表达有显著的敲减作用，因而选择Target3:5’—GAGATCAGGTTCTGGACAA—3’和Target4：5’—GGAGAGCTATTGAAATTGT—3’，分别记为KD1和KD2，作为下一阶段实验的RNAi有效靶点序列。 第三部分靶向Cdc6 RNAi慢病毒载体的构建及其抑制舌癌细胞增殖的研究 方法： 1、慢病毒载体的制备、滴度测定和Tca8113细胞转染效率的测定 2、靶向Cdc6慢病毒载体RNAi系统敲减效能的检测： ①Real time RT—PCR和Western Blot检测RNA干扰对Tca8113细胞Cdc6 mRNA和蛋白表达水平的敲减效能。 ②流式细胞仪检测细胞周期改变 ③MTT法检测Tca8113细胞生长水平 ④细胞小室侵袭实验检测Tca8113细胞侵袭率 结果： 1、成功制备2条靶向Cdc6 RNAi慢病毒载体KD1和KD2，病毒滴度分别为1.8x109TU/ml和8.0x108TU/ml。该慢病毒载体可有效感染舌癌Tca8113细胞株，最佳感染条件为MOI=20。 2、Real time RT—PCR结果显示：KD1和KD2靶点对Tca8113细胞Cdc6 mRNA的表达均有显著敲减效果(p<0.05)。相对NC组，KD1、KD2组对Cdc6基因敲减效率分别为50％和65％。 3、Western Blot结果显示：感染靶向Cdc6 RNAi慢病毒载体后，Tca8113细胞Cdc6蛋白表达水平明显下降，KD1、KD2组较NC组Cdc6蛋白表达降低分别为65.87％、79.38％。 4、流式细胞仪检测细胞周期显示：感染慢病毒载体后，KD组S期细胞比率明显下调，KD1组较NC组下调41.53％，KD2组下调43.52％，KD组G1期细胞比率上调，但没有出现明显的凋亡峰。 5、MTT法检测细胞生长水平：KD组细胞生长水平受到抑制，KD1细胞生长抑制率为25.84％，KD2细胞生长抑制率为30.34％。 6、细胞小室侵袭实验结果显示：靶向Cdc6 RNAi慢病毒载体感染Tca8113后，细胞侵袭率未见明显改变。 结论： 1、DNA复制起始蛋白Cdc6和Mcm7在舌癌和癌前病变组织中呈高表达，其高表达与舌癌的发生及转移有相关性，推测其可能在舌癌发生与淋巴结转移中起重要作用。检测舌癌组织中Cdc6和Mcm7的表达可望成为其早期诊断与判断预后的分子指标之一。 2、靶向Cdc6慢病毒载体RNA干扰能有效下调舌癌Tca8113细胞中Cdc6 mRNA和蛋白的表达水平，抑制Tca8113细胞的DNA复制，从而阻止舌癌细胞的增殖。Cdc6有望成为一种有前景的治疗舌癌的新靶点，深入研究Cdc6与其他调控因子在整个细胞癌变及逆转过程中的相互作用关系，对于揭示Cdc6的作用机制及其对舌癌的治疗有重要的理论指导和临床应用意义。