腭裂是人类常见的先天性畸形之一，其发病原因较为复杂，目前多倾向于由遗传与环境因素的共同作用所致，且与多个基因有关，是一种多基因遗传病。其发病机制可能与细胞的增殖与凋亡，多种细胞因子及其受体表达的改变等有关。但腭部发育及腭裂形成过程中相关基因的确切作用和其表达的变化尚不明确。因此，研究腭裂的发病机理及探寻有效的防治措施显得尤为重要。 全反式维甲酸（all trans retinoic acid，ATRA）是维生素A的代谢物，生理水平的维甲酸能够调控细胞的增殖和分化，与正常的生长发育密切相关；而过量的维甲酸有明显的毒副作用，可以诱导多种生物的组织器官形成畸形。ATRA诱导腭裂形成的原因可能与调控腭间充质细胞凋亡，干扰上皮一间充质转化及中嵴上皮的消退等有关，但其确切的作用机制仍有待研究。 叶酸（folic acid，FA）是一种水溶性B族维生素，由喋啶核、对氨苯甲酸及谷氨酸三部分组成，在细胞生长、分化、修复和宿主防御等方面扮演重要角色，是DNA和RNA合成过程中需要的重要物质。叶酸缺乏影响细胞的正常代谢，导致包括腭裂在内的多种先天性畸形发生。作为一种预防腭裂的有效药物，叶酸在临床上已经被广泛应用，但其作用机理仍不明确。 本研究建立维甲酸诱导腭裂模型，应用腭器官体外培养法，模拟腭板的生长及融合过程，并检测维甲酸受体的时空表达变化，阐明ATRA诱导腭裂的分子机制。叶酸是一种腭裂预防的常用药物，研究其预防ATRA诱导腭裂的作用机制，可为减少腭裂的发生提供有益的参考。 目的： 1．建立维甲酸腭裂模型，应用腭器官体外培养法，观察不同条件下腭板的生长及融合情况。 2．检测维甲酸受体RARα、RARβ及RXRα在胚胎腭中的时空表达变化，阐明ATRA诱导腭裂的分子机制。 3．研究叶酸预防ATRA诱导腭裂的作用机制，为腭裂预防提供有益的参考。 研究方法： 1．腭器官体外培养模型选取10周龄左右SPF级C57BL/6J近交系小鼠，于第一天晚8时按雌雄比1∶1合笼交配，第二天上午8时检测阴栓，将阴栓阳性的雌鼠记为妊娠0天（gestation0 day，GD0）。孕鼠于GD14处死，将胎鼠从母鼠子宫内取出，在无菌条件下解剖出胎鼠的双侧腭板，放入盛有DMEM/F12培养基的器官培养皿中。将ATRA溶于无水乙醇，叶酸溶于NaOH，随DMEM/F12培养基加入培养皿中，使ATRA终浓度分别为1μM、10μM，叶酸的终浓度为0．1mM。实验分6组，即对照组、ATRA1μM组、ATRA10μM组、Folic acid组、ATRA10μM+FA（0h）组、ATRA10μM+FA（24h）组，每组有8个样本。将培养皿置于含5％CO2、37℃恒温箱中，分别培养24小时、48小时及72小时后取出腭板，吖啶橙染色，镜下观察各组腭板在不同时间点的组织学形态。然后将腭板用福尔马林溶液固定，石蜡包埋、切片，HE染色后观察。 2．维甲酸诱导腭裂的机理及叶酸的预防作用研究免疫组化染色法检测各组腭板中维甲酸受体RARα、RARpβ及RXRα的时空表达变化，从而推断出维甲酸诱导腭裂的机理及叶酸预防腭裂可能的原因。 结果： 1．本实验成功地建立维甲酸诱导腭裂模型，运用腭器官体外培养法，观察不同条件下腭板的组织学形态。可见培养24小时、48小时和72小时后，对照组腭板的融合数分别为4、7、8，而1μM及10μM ATRA组未见腭板融合，差异有显著性（P<0．05），说明过量的ATRA具有明显的致畸性，能够诱导腭裂形成。ATRA10μM+FA（0h）组各个时间点腭板的融合数为4、5、6，与对照组和叶酸组相近，而与ATRA组差异明显（P<0．05），表明叶酸能够预防ATRA诱导的腭裂。ATRA10μM+FA（24h）组培养48小时后腭板的融合数仅为1，与对照组差异显著（P<0．05），提示叶酸尽管可以有效预防ATRA诱导的腭裂，但却没有治疗的功效。 2．应用免疫组化法检测维甲酸受体的变化发现：RARα、RARβ及RXRα在胚鼠腭中呈胞核表达，其表达的变化随腭部的发育阶段和腭突的不同部位而有差异。ATRA诱导RARα的表达作用不明显，随ATRA浓度的升高，RARα的表达略有增强，主要见于腭间充质细胞。ATRA可明显上调RARβ的表达，且与部位、时间及ATRA浓度有关。ATRA浓度越高，诱导RARβ表达的作用越强，且多见于腭板融合期的间充质和口腔侧上皮。ATRA在腭板融合期可以明显地抑制RXRα在间充质中的表达，并稍增强其在上皮中表达。早期加入叶酸可以拮抗ATRA的作用，使维甲酸受体RARα、RARβ及RXRα在腭部的表达情况接近于对照组。但如果在ATRA作用24小时后再加入叶酸，则无这种效果，可见其维甲酸受体表达情况与对照组差异明显，而与ATRA组基本相同。 结论： 1．本研究成功建立维甲酸诱导腭裂模型。通过腭板器官体外培养法，基本可以重复体内双侧腭突接触融合过程。并通过向腭板培养基中加入不同浓度ATRA，建立维甲酸诱导腭裂模型，为研究腭裂的发病机理提供了可靠的手段。 2．成功运用叶酸预防ATRA诱导的腭裂。运用叶酸时需注意时间和剂量，只有早期应用适量的叶酸，才能有效地预防ATRA诱导的腭裂。 3．ATRA诱导腭裂与其调控维甲酸受体RARα、RARβ及RXRα在腭部发育时期和腭突的不同部位的特异性表达变化密切相关。早期应用适量的叶酸可纠正ATRA诱导的维甲酸受体异常表达，从而预防腭裂形成。而晚期应用叶酸则无治疗的功效，不能预防ATRA诱导的腭裂。