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目的探讨HIF-1在介导间充质干细胞动员治疗缺血缺氧性脑损伤中的作用及机理。方法(1)小鼠MSCs的体外培养及鉴定:利用贴壁筛选法获得MSCs,并进行常氧、缺氧培养;流式细胞仪检测MSCs表面标志物CD44,CD45及CD90的表达;绘制生长曲线,研究常氧培养和缺氧培养MSCs的生长特点。(2)HIF-1αα对MSCs SDF-1/CXCR4调控作用的研究:实验分成常氧组、缺氧组、转染Control siRNA组、转染HIF-1α siRNA常氧培养组、转染HIF-lα siRNA缺氧培养组,RT-PCR和Western blot检测各组MSCs的HIF-1α、SDF-1α、CXCR4 mRNA及蛋白表达情况。(3)HIF-1信号通路在介导MSCs动员治疗缺血缺氧性脑损伤中的作用及机理研究:①制作小鼠缺血缺氧性脑损伤模型,实验分为假手术组、对照组、DFX组、SDF-1组,CFU-F法检测外周血与骨髓中MSCs的数量;②RT-PCR和Western blot检测各组造模后7d、14d、21d海马组织中HIF-1α、SDF-1α、CXCR4mRNA及蛋白表达情况;③造模后14d进行Morris水迷宫实验,观察小鼠空间学习记忆能力的变化;④HE染色观察各组造模后7d、14d、21d脑损伤病理改变和修复情况;⑤免疫组化检测各组造模后7d、14d、21d脑组织Bcl-2、Caspase3的表达情况。结果(1)流式细胞仪检测结果显示,第3代MSCs对造血干细胞表面标志CD45表达阴性,为8.56%,而CD44,CD90表达阳性,分别为96.1%、99.4%,说明分离培养的细胞是小鼠MSCs;缺氧培养的MSCs生长曲线也呈“S”型,且细胞数量超过常氧培养的MSCs。(2)HIF-1α对MSCs SDF-1/CXCR4调控作用的研究结果:缺氧组HIF-1α、SDF-1αα CXCR4mRNA及蛋白表达水平较常氧组均明显提高(P<0.05);转染HIF-1α siRNA常氧培养组HIF-1α、SDF-1α、CXCR4 mRNA及蛋白表达水平较转染Control siRNA 组有所降低(P<0.05);且转染 HIF-1α siRNA 缺氧培养组 HIF-1α、SDF-1α、CXCR4 mRNA及蛋白表达水平较缺氧组降低(P<0.05)。(3)HIF-1信号通路在介导MSCs动员治疗缺血缺氧性脑损伤中的作用及机理研究结果:①CFU-F法检测外周血、骨髓MSCs数量结果显示,同一时间内,对照组外周血MSCs数量高于假手术组(P<0.05),对照组骨髓MSCs数量与假手术组比较无显著性差异(P>0.05),说明小鼠脑缺血缺氧后机体自身存在自我动员。DFX组(3d)和SDF-1组(3d)外周血MSCs数量虽然高于对照组,但无显著性差异(P>0.05),说明给予DFX及细胞因子SDF-1α 3d时对MSCs动员到外周血的作用很弱;DFX组(7d)和SDF-1组(7d)外周血MSCs数量明显高于对照组(P<0.05),说明给予DFX及细胞因子SDF-1α 7d时对MSCs动员到外周血的作用较强;DFX组和SDF-1组不同时间点骨髓MSCs数量与对照组比较均无显著性差异(P>0.05)。以上结果说明,给予DFX及细胞因子SDF-1α一周,外周血MSCs数量增加,动员效率提高。②各组海马组织中HIF-1α、SDF-1α、CXCR4 mRNA的表达水平均在7d、14d、21d均明显高于假手术组(P<0.05);DFX组与SDF-1组HIF-1α、SDF-1αα CXCR4mRNA的表达水平较对照组均有所增加(P<0.05),且在14d时表达最高;各组海马组织中HIF-1α、SDF-1α、CXCR4蛋白的表达水平均明显高于假手术组(P<0.01);DFX组与SDF-1组HIF-1α蛋白的表达水平均较对照组显著增加(P<0.01),且在14d时表达最高。③Morris水迷宫实验结果:对照组小鼠在原平台象限的时间比例为(24.02±5.69)%,低于假手术组(30.09±5.07)%(P<0.05)。DFX组小鼠在原平台象限的时间比例为(28.04±2.70)%,SDF-1组小鼠在原平台象限的时间比例为(29.41±5.54)%,均明显高于对照组(P<0.05)。④HE染色结果显示,DFX组与SDF-1组7d时,海马内有坏死细胞,胶质细胞增生,14d、21d时海马区虽仍有细胞变性、坏死现象,但较对照组减轻。⑤免疫组化检测脑组织Bcl-2、Caspase3的表达结果显示,DFX组与SDF-1组在7d时Bcl-2、Caspase3阳性细胞数量与对照组无显著性差异(O>0.05),但14d、21d较对照组明显减少(P<0.01)。结论本课题利用贴壁筛选法从小鼠骨髓中所获细胞经鉴定为MSCs,缺氧培养对MSCs增殖具有促进作用;缺氧可使MSCs HIF-1α、SDF-1α、CXCR4 mRNA和蛋白的表达提高,常氧与缺氧条件下抑制HIF-1α的表达均可使SDF-1α、CXCR4 mRNA和蛋白的表达降低,提示HIF-1α对MSCs SDF-1/CXCR4具有调控作用;DFX及SDF-1α可通过激活HIF-1α及下游SDF-1/CXCR4信号促进MSCs动员治疗缺血缺氧性脑损伤,增加外周血MSCs数量,提高MSCs动员效率,改善缺血缺氧性脑损伤小鼠的空间学习记忆能力,抑制细胞凋亡,促进脑损伤组织的恢复。