【背景】肝再生医学一直处在再生医学的最前沿，原位肝移植和肝细胞移植均属于肝再生医学的范畴，原位肝移植被认为是目前治疗终末期肝病最行之有效的方法。但是由于供肝源缺乏、费用昂贵、免疫排斥等问题使原位肝移植不能成为最主要的治疗方式。肝细胞移植可以有效改善终末期肝病患者的肝功,但肝细胞移植目前存在的问题主要有以下两点：1.依靠供体器官获得肝细胞，来源缺乏。2.冻存后的肝细胞会丢失部分肝细胞的功能，所以肝细胞在获得后必须立即使用,这也限制了其在临床的应用。因此,不依赖于器官捐献获得有功能的肝细胞样细胞，就成了肝再生医学亟待解决的问题，获得有功能的iHEP有望解决供肝和肝细胞来源不足的问题，这对于肝再生医学的发展而言至关重要。目前，iHEP是通过诱导胚胎干细胞(EMC)、诱导性多能干细胞(iPS)、间充质干细胞(MSC)和成纤维细胞而获得。EMC诱导的iHEP细胞移植到动物体内后有较高的致肿瘤性、致畸胎瘤性且由于受到伦理学的限制，因此目前仅用于药理学和基础医学研究。iPS是由各种终末细胞去分化而获得的EMC样细胞，具有和干细胞类似的分化潜能，在理论上，由iPS获得的iHEP细胞来源于患者自身，所以不存在免疫排斥和伦理学的问题，但由于iPS的获得需要转录因子的转染，效率低下且改变了宿主基因，由iPS再分化为iHEP细胞，效率更低，且同样存在致肿瘤性、致畸胎瘤性的风险。由成纤维细胞直接转化为iHEP细胞是近年来新的发现，由成纤维细胞转分化为iHEP细胞的效率较低，且iHEP不具备成熟肝细胞的某些重要功能。MSC可作为种子细胞的优势在于：其来源广泛、非侵入性获得、不存在伦理学问题，移植入动物体内后具有低免疫原性、低致瘤性、低致畸胎瘤性。并且脐带MSC已经成为再生医学理想的细胞来源。由于目前的MSC来源的iHEP细胞还不够成熟，且分化效率欠佳。为了获得MSC来源的有功能的iHEP细胞,探索其分化机制就成了肝再生医学亟待解决的问题。MicroRNA是近年来发现的一类内源性非编码小RNA，通过抑制该配对区域mRNA的翻译或促进其降解从而在转录后水平负性调控靶基因的表达。多项研究显示microRNA参与体内多种生理过程的调控：广泛参与体内细胞的增殖、分化、发育、代谢、凋亡等多种生理活动。且近来多项研究显示microRNA参与各种细胞表型的转化。【目的】本课题小组前期工作基础：⑴成功建立了MSC向肝细胞分化的体外模型；⑵根据microRNA基因芯片和PCR的一致性比对筛选出6个在MSC向肝细胞分化过程中线性升高的一组microRNA（miR-30a、miR-1290、miR-1246、miR-542-5p、miR-424、miR-148a)；⑶单独使用该组microRNA和肝特异性miR-122诱导间充质肝细胞，成功地将MSC诱导为有功能的诱导性肝细胞样细胞(iHEP)。因此本实验的目的是：在上述工作的基础上进一步筛减诱导MSC向肝细胞样细胞分化的关键microRNA。【方法】1.使用酶消化法分离脐带MSC：在无菌条件下采集健康孕妇所产足月儿的脐带，胶原酶消化法获得纯化的MSC，从大体形态、表面抗原鉴定、骨向分化能力等方面证实该方法分离的细胞是否为MSC，并检测其纯度和分化能力。2.使用（n-1）的筛减策略：在7mix可诱导MSC为有功能的iHEP细胞的基础上，依次使用筛减不同microRNA的6mix组合诱导MSC；若6mix组合可诱导MSC为有功能的iHEP细胞，则依照上述策略依次使用筛减不同microRNA的5mix组合诱导MSC，直到筛减到可将MSC诱导为iHP细胞的最少microRNA组合。3. iHEP细胞的验证：倒置显微镜下观察大体形态的变化；使用q-PCR对肝基因在mRNA水平变化进行检测；western-blot对肝细胞特异蛋白进行检测；肝细胞特异性功能检测：PAS糖原染色、LDL摄取实验、尿素氮合成能力、ICG心脏绿的摄取实验的检测用来验证microRN诱导的iHEP细胞是否具有成熟肝细胞样的功能。【结果】1.本课题小组使用酶消化法分离的MSC在镜下显示典型的扁梭状，4代以后呈现典型的涡旋状生长方式。流式细胞仪分析表面抗原鉴定结果显示：本实验小组分离的脐带来源的第四代(p4)MSC99.5%可表达MSC的标志分子CD105。同时内皮标志分子CD31以及造血干细胞CD34的检测结果分别为：1.0%、1.0%，这一结果说明本实验小组分离的MSC并没有参杂内皮细胞和血细胞，即证实了本课题小组分离的MSC纯度较高。同时利用MSC向骨细胞分化诱导液，来验证分离所得MSC的分化潜能。结果显示：向p4的MSC内加入骨细胞向诱导分化培养液16天后，分化的细胞经Alizarin红染色后显示（+），即具有骨细胞特有的钙盐沉积的作用。钙盐沉积的作用是骨细胞所特有的功能，证实了分离出的MSC具有分化潜能。2.6mix组合诱导结果显示：各组合的mimics转染效率均较高，6mix-without-miR-30a(miR-122、miR-1290、miR-1246、miR-542-5p、miR-424、miR-148a)组合转染MSC后的iHEP细胞的特征：细胞具有肝细胞特有的上皮样细胞形态，q-PCR检测肝细胞的特异性基因表达增高，较7mix（miR-122、miR-1290、miR-1246、miR-542-5p、miR-424、miR-148a、miR-30a）诱导的iHEP细胞，肝细胞特有的ALB的表达略有降低，肝细胞特异性功能检测：PAS染色、尿素氮合成检测、ICG摄取实验、LDL摄取实验结果均为阳性。6mix-without-miR-1290诱导组的肝基因表达亦较高但低于6mix-without-miR-30a诱导组。而其他6mix诱导组的肝基因表达变化与阴性对照相比无统计学差异。3.5mix组合诱导结果显示：各组合的mimics的转染效率均较高，5mix-without-miR-1290（miR-122、miR-1246、miR-542-5p、miR-424、miR-148a）组合转染MSC后细胞具有肝细胞的上皮样形态，肝细胞的特异性基因表达增高，较6mix（miR-122、miR-1290、miR-1246、miR-542-5p、miR-424、miR-148a）诱导组和7mix诱导组，早期肝基因变化无明显差异，而中晚期肝基因TF、CYP3A4、G6P表达降低。肝细胞特异性功能检测：PAS染色结果、尿素氮检测、ICG摄取实验结果、LDL摄取实验结果均为阳性。而其他5mix诱导组的肝基因表达变化与阴性对照相比无统计差异。4.4mix组合诱导结果显示：4mix-without-miR-542-5p中AFP的升高具有统计学意义；其他4mix组合肝基因ALB、HNF4A变化较阴性对照无明显差异。【结论】使用酶消化法获得的脐带来源的MSC，具有MSC典型的成纤维细胞样形态，表达MSC的标志分子，且可分化为骨细胞样细胞。miR-122、miR-1246、miR-542-5p、miR-424、miR-148a转染MSC后细胞可诱导为有功能的iHEP细胞：具有肝细胞的上皮样形态，肝细胞的特异性基因表达增高，肝细胞特性功能检测：PAS染色结果、尿素氮检测、ICG摄取实验结果、LDL摄取实验结果均为阳性。miR-1290和miR-30a是间充质干细胞向肝细胞分化过程的非必需microRNA。首次证实miR-122、miR-1246、miR-542-5p、miR-424、miR-148a可将MSC分化为有功能的iHEP细胞。