研究背景:卵巢恶性肿瘤是女性常见的恶性肿瘤之一,其中上皮来源的卵巢恶性肿瘤是所有恶性肿瘤的主要类型,并且成为死亡率第4的恶性肿瘤,是全球致死率最高的妇科肿瘤。手术联合化疗是目前治疗卵巢癌的常用手段,然而卵巢癌治疗后复发率高,并且在治疗过程中副作用较多。针对不同分子的特异性抗体的出现使分子靶向治疗为卵巢癌的治疗带来希望,并且已有多种单克隆抗体已进入临床实验研究,应用特异性抗体后肿瘤患者的无进展生存期的延长、总生存率的提高、患者生活质量的改善起了重要作用,因此抗体具有良好的应用前景。然而,应用抗体治疗后耐药情况的出现严重影响了疾病整个预后。因此,探究卵巢癌经抗体治疗后产生耐药的原因,并找寻可能的干预策略,对于提高卵巢癌患者的总生存期具有重要意义。在实验室工作者的先前工作中,经过高浓度的曲妥株单抗的诱导并成功筛选获得一株对曲妥株单抗耐药的细胞株SKOV3-T细胞。众所周知,VEGF是最常见的血管内皮生长因子,并且参与了许多机体的生理及病理过程。重要的是VEGF通过影响肿瘤血管生成促进肿瘤细胞的生长及迁移。目的:在获得曲妥珠单抗耐药的卵巢癌模型中探讨耐药肿瘤的耐药发生的机制,旨在寻找克服耐药的方法。方法:通过借助免疫组化、体外细胞的增殖、鼠内成瘤等实验方法,比较SKOV3和SKOV3-T细胞对肿瘤的发生及肿瘤血管的形成的影响。通过细胞增殖、反转录PCR、细胞迁移、酶联免疫吸附等方法发现VEGF在SKOV3-T细胞中过表达,并且VEGF的表达量增高与SKOV3-T细胞形成的肿瘤恶性水平的增强存在重要的关系。进一步借助免疫印迹、核浆分离、激光共聚焦等实验技术探究VEGF提高肿瘤恶性程度的机制。并利用细胞转染技术在SKOV3-T细胞中转入SP1 shRNA敲低SP1的表达水平,探讨SP1对VEGF表达的调控,并探寻SP1转录因子在曲妥珠单抗耐药中发挥的作用。SP1敲低后筛选获得了SP1低表达的克隆,然后借助体内成瘤、免疫组化等方法进一步探讨SP1对耐药肿瘤恶性程度的影响。结果:SKOV3与SKOV3-T细胞体内成瘤的比较发现SKOV3-T细胞形成的移植物体积明显和血管密度明显大于SKOV3细胞形成的移植物,并且移植物的外形更不规则,暗示对曲妥珠单抗耐药细胞系SKOV3-T细胞的肿瘤发生及血管生成能力增强;体外细胞的增殖实验结果示用SKOV3-T细胞培养上清培养的HUVECs增殖量明显升高,同时ELIS A及RT-PCR实验均验证了 VEGF在SKOV3-T细胞中确实高表达,并且抗VEGF抗体(Avastin)抑制SKOV3-T细胞的迁移,同时存在剂量依赖性,推测由于VEGF的过表达使SKOV3-T细胞的迁移能力增强;Western Blot及激光共聚焦实验发现SP1在SKOV3-T细胞中的高表达是SKOV3-T细胞中VEGF高表达的关键因素,并且SP1敲低后ELISA及RT-PCR均显示细胞VEGF的表达量降低,同时SKOV3-T细胞的迁移能力明显下降;最后体内成瘤实验发现SP1敲低后形成的移植物体积明显和血管密度明显减小,验证了SP1敲低SK0V3-T细胞的肿瘤生长及血管生成受到抑制。结论:在卵巢靶向治疗后出现抗体耐药的过程中,肿瘤相关生物标记物SP1的表达被诱导上调,表现为曲妥株单抗耐药的细胞SKOV3-T的血管生成、迁移、体内成瘤能力均比原代卵巢癌细胞SKOV3的能力显著增强;体内外实验同样证实了在SKOV3-T细胞中通过SP1过表达诱导VEGF的表达量增多,使SKOV3-T细胞的恶性程度增强(血管生成、迁移、体内成瘤能力均明显增强);SKOV3-T细胞转染SP1 shRNA后,细胞中的SP1被敲低,细胞的血管生成和体内成瘤能力均下降,表明SP1分子是SKOV3-T维持细胞生长、转移的重要因素之一,可以作为将来靶向治疗的良好靶标,并且为多靶点联合用药提供了依据。