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肝细胞生长因子受体(Hepatocyte growth factor receptor, c-Met)具有酪氨酸激酶活性,此受体被HGF激活过度表达后对多种细胞的增殖、分化及浸润运动等都有调节作用,并被认为与胃癌的发生、发展、侵袭、转移及不良预后有密切关系。RNA干扰技术已在基因治疗中应用多年,siRNA基因药物具有高特异性及低毒副作用的特点,小量siRNA即可有效沉默目的基因,抑制率较大,在肿瘤治疗中是一颗耀眼的新星。阿霉素(doxorubicin,DOX)是一种葱环类抗生素,广泛用于抗肿瘤的治疗。但其疗效受限于剂量依赖性的心脏毒性,骨髓抑制及多药耐药性。本研究采用功能化的单壁碳纳米管来接载DOX,然后静电吸附阳离子脂质体DOTAP,使制剂形成正电性后,与靶向c-Met的siRNA正负电吸附,同时载带两种药物制成联合药物,以期起到基因治疗与化疗联合作用效果,增强治疗效果的同时降低阿霉素的毒副作用。
本研究首先依据RNAi原理,设计并合成了以c-Met基因为靶点的几条siRNA序列,以胃癌细胞SGC-7901为研究对象,以脂质体LipofectaminTM2000为载体通过体外转染胃癌细胞SGC-7901进行有效序列的筛选。以SRB法检测其对细胞增殖的抑制作用,采用RT-PCR技术检测其对c-Met mRNA表达的抑制作用,筛选出siRNA-3为最为有效的序列。其可明显抑制胃癌细胞SGC-7901的增值,抑制率为39.1%;对c-Met mRNA表达的沉默效率为81.08%。
本研究成功地以表面活性剂分散氧化后的单壁碳纳米管(Oxidized single-walled carbon nanotube,O-SWNTs),物理吸附阿霉素,形成SWNT-DOX纳米制剂,并对其进行一系列考察。制剂外观较为均一稳定,且载药率高达98%;通过FT-IR研究表明,经过化学修饰在碳纳米管表面稳定形成羧基基团,并且SWNT-DOX制剂中SWNT已将DOX吸附上,形成新的制剂;使用纳米粒度仪测定SWNT-DOX具有良好的粒径分布和理想电位,稳定性良好;体外释放结果表明SWNT-DOX为缓释制剂,且在微酸性介质中释放较快;用SRB法检测碳纳米管载体在一定给药剂量范围内毒性较小,原料药阿霉素在低浓度时细胞毒性较大,而SWNT-DOX在同浓度下抑制作用小于原料药,说明其具有缓释作用,细胞毒减小,在体内作用时可能会减低心脏毒性。
本文的第三部分成功地合成了SWNT/DOX/DOTAP/siRNA联合制剂,使用琼脂糖凝胶电泳确定了SWNT载体系统成功承载了siRNA;利用荧光显微镜、透射电镜及流式细胞术定性及定量的考察了联合制剂中DOX及siRNA进入细胞的能力及多少,结果证明此载体系统可更为有效的递送siRNA进入细胞;通过SRB法检测到联合制剂对细胞的抑制率为78.05%,远远高于同浓度下单独药物的抑制率。通过流式细胞仪对凋亡率的检测结果表明,SWNT/DOX/DOTAP/siRNA载体系统对SGC-7901细胞的凋亡率显著增高。
最后,对SWNT-DOX制剂在体内药物动力学及组织分布情况做了初步考察,发现相较于原料药阿霉素,SWNT-DOX制剂可延长药物在血液的循环时间,半衰期延长,使药效更持久,且可降低小鼠的心脏毒性。对制剂在体内药效学情况做了初步考察,发现联合制剂的抑瘤率最大,与其他对照组都显现出显著性差异。
本研究对SWNT/DOX/DOTAP/siRNA载体系统进行了较为系统的研究,通过各项指标的考察,表明此系统具有良好的联合疗效,且可以降低阿霉素的心脏毒性。由此可见,该联合治疗系统具有显著的优势。该研究为探索肿瘤治疗的新方法提供了重要参考依据。