实验背景:阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease,AD）是最常见的神经退行性疾病,其最主要的特征之一是淀粉样斑块沉积。淀粉样斑块主要由β-淀粉样蛋白（β-amyliod protein,Aβ）组成,也被称为Aβ斑块。Aβ斑块具有极强的神经毒性,是AD发生发展中的关键因素。Aβ斑块是由Aβ不断在脑中累积后形成的,Aβ则由Aβ前体蛋白APP（amyloid precursor protein,APP）经过淀粉样途径,依次被β分泌酶和γ分泌酶剪切后产生。AD的病因和发病机制复杂,涉及到许多方面,提出的假说包括Aβ级联假说、异常神经活动假说、Tau蛋白假说、神经炎症假说等等,在这些假说中,Aβ级联假说占主导地位,该假说认为Aβ累积是AD发病的主要原因。星形胶质细胞是哺乳动物脑内分布最广泛的一类细胞,在中枢神经系统（Central Nervous System,CNS）发生疾病或者损害时,“静息态”星形胶质细胞会转变为“反应性”星形胶质细胞,其功能也会发生改变。AD中Aβ斑块周围围绕着许多反应性星形胶质细胞,并且此变化可促进AD早期Aβ沉积。此外,星形胶质细胞表达一定水平的APP、β分泌酶以及γ分泌酶,即使单个星形胶质细胞产生的Aβ少于神经元,但由于星形胶质细胞的数量至少是神经元的五倍,在AD长达十几年的发病潜伏期中,使得星形胶质细胞也成为脑中Aβ的重要来源,这是以往研究中容易被忽略的部分。电压门控Na+通道（Voltage-gated sodium channe,Nav）不仅是动作电位开始和传播的关键通道,也是影响神经元兴奋性的关键通道。研究发现,Nav功能异常与许多神经系统疾病密切相关。目前有9种不同的钠通道亚型（Nav1.1-Nav1.3、Nav1.5-Nav1.9和Nav X）已经被检测到。在CNS中表达的钠通道亚型包括Nav1.1、Nav1.2、Nav1.3、Nav1.5和Nav1.6。其中,Nav1.6通道是成人CNS表达最丰富的钠通道亚型,是体内神经元兴奋性的关键决定因素。此外,Nav1.6通道同样表达于不可兴奋性细胞,如星形胶质细胞和小胶质细胞中。此时Nav1.6发挥着与动作电位形成不太相关的功能。在小胶质细胞Nav的亚型（Nav1.1、Nav1.5和Nav1.6）中,Nav1.6的表达最显著,并且随着疾病的严重程度越深,Nav1.6表达上调的情况越明显。Nav1.6通道具有调控小胶质细胞的吞噬、迁移和趋化因子/细胞因子释放的能力。然而在星形胶质细胞Nav亚型（Nav1.2,Nav1.3,Nav1.5和Nav1.6）中,Nav1.5的表达最显著,于是大部分研究主要围绕Nav1.5展开,使得Nav1.6在星形胶质细胞中的功能未得到充分了解,鉴于Nav1.6在CNS中的重要地位,探讨Nav1.6在星形胶质细胞中的功能也显得尤为关键。我们实验室今年刚发表于Aging Cell杂志上的一篇文章已证实,下调脑中Nav1.6的表达能减轻AD的病理改变,然而星形胶质细胞Nav1.6在AD中发挥怎样的作用,这种作用又是如何影响神经元的功能目前是未知的。AD中Aβ的产生受到自噬降解APP的严格调控。自噬是一种溶酶体介导的降解途径,在自噬过程中,功能失调的细胞器和大分子物质被包裹在自噬小体中,接着自噬小体与溶酶体融合后形成自噬溶酶体,自噬溶酶体的正常降解对维持细胞的内环境稳态起到重要作用。m TOR信号通路在调控自噬中发挥重要作用,它在AD患者中表达增强反映了基础自噬水平降低。在AD动物模型中,抑制m TOR能够促进自噬,并且降低AD小鼠Aβ斑块沉积,改善AD小鼠认知能力。在神经元中过表达自噬-溶酶体途径相关的调节因子,能诱导APP降解并减少Aβ生成。这些结果表明自噬溶酶体途径在AD中发生了障碍,影响了Aβ的清除,并且加重AD病情。目前少有研究探讨星形胶质细胞自噬在神经退行性疾病中发挥的作用,特别是星形胶质细胞Nav1.6与自噬之间是否存在关联,这种关联背后的机制是什么,对AD的发展起到怎样的作用,这些问题正是本课题的研究目的。因此,本实验利用sh RNA病毒干扰,特异性敲低星形胶质细胞Nav1.6,探究星形胶质细胞Nav1.6对AD模型鼠认知障碍以及相关神经病理的影响,并进一步研究其机制,为临床防治AD提供药物靶点（下调星形胶质细胞Nav1.6对APP/PS1小鼠的神经保护作用,特别是其对神经元突触形态和功能的保护作用,已由本实验室另外一位同学完成,数据尚未发表）。实验方法:1.构建靶向敲低星形胶质细胞Nav1.6的AAV病毒及空载病毒,通过脑立体定位将其注射于小鼠双侧海马。病毒载体名称分别为p AAV-Gfa ABC1D-m Cherry-mi R30sh RNA（Nav1.6）-WPRE以及p AAV-Gfa ABC1D-m Cherry-mi R30sh RNA（NC）-WPRE。实验分组为4组:野生型条件敲低对照组（WT-GFAP-vector）,野生型条件敲低组（WT-GFAP-Nav1.6）,APP/PS1条件敲低对照组（APP/PS1-GFAP-vector）,APP/PS1条件敲低组（APP/PS1-GFAP-Nav1.6）。2.行为学实验检测小鼠的学习记忆能力。旷场实验（Open field test）检测小鼠基础的运动能力。新物体识别（New object recognition,NOR）实验和Y迷宫（Y maze）实验检测小鼠的短期记忆能力。水迷宫（Morris water maze,MWM）实验检测小鼠的长期记忆能力。被动回避（Passive avoidance,PA）实验检测小鼠对恐惧的记忆能力。3.脑片膜片钳检测小鼠神经网络的改变以及神经元兴奋性,评估各组小鼠兴奋性突触后电位和神经元动作电位的差异。4.免疫组化检测小鼠星形胶质细胞和小胶质细胞的病理改变。Western blot检测小鼠海马中上述两种胶质细胞的标志物GFAP和Iba1的表达水平。Confocal检测Aβ斑块周围胶质细胞激活的形态改变。5.免疫组化检测APP/PS1鼠Aβ斑块的沉积。Western blot检测Aβ形成过程中,其前体蛋白（APP）、相关剪切酶（BACE）及剪切蛋白（s APPβ）的表达。6.透射电镜检测APP/PS1鼠自噬小体和自噬溶酶体的表达。Western blot检测APP/PS1鼠自噬-溶酶体相关蛋白（ATG5,ATG7,LC3Ⅱ/Ⅰ,P62,Lamp1）的表达。7.Western blot检测APP/PS1鼠和原代培养的星形胶质细胞,自噬相关信号通路的蛋白（p-ERK与ERK、p-AKT与AKT、p-m TOR与m TOR和p-ULK与ULK）表达。8.病毒下调原代培养的星形胶质细胞Nav1.6或者直接培养Nav1.6敲除的原代星形胶质细胞,Western blot检测细胞Nav1.6的总蛋白、膜蛋白以及其在星形胶质细胞中的分布改变。检测自噬-溶酶体相关蛋白（ATG5,ATG7,LC3Ⅱ/Ⅰ,P62,Lamp1）的表达。9.体外培养过表达Nav1.6的HEK293细胞系和Nav1.6敲除的原代星形胶质细胞,全细胞膜片钳记录过表达Nav1.6的HEK293细胞上的Nav1.6电流或原代培养的星形胶质细胞的整体钠离子电流以及钠钙交换体电流,Fluo-4AM荧光探针检测细胞内Ca2+的表达水平。10.共聚焦检测自噬小体和溶酶体以及APP和溶酶体在星形胶质细胞中的结合情况。加入自噬抑制剂3-MA或者溶酶体抑制剂CQ后,检测自噬-溶酶体途径被抑制后对星形胶质细胞APP蛋白的表达所产生的影响。实验结果:第一部分下调星形胶质细胞Nav1.6对APP/PS1小鼠认知功能和神经网络的影响1.1.下调星形胶质细胞Nav1.6改善APP/PS1小鼠认知功能NOR实验和Y maze实验发现下调星形胶质细胞Nav1.6提高APP/PS1鼠短期的记忆能力。MWM实验发现下调星形胶质细胞Nav1.6改善APP/PS1鼠长期的记忆能力。PA实验发现下调星形胶质细胞Nav1.6改善APP/PS1鼠对恐惧情境的记忆能力。1.2.下调星形胶质细胞Nav1.6改善APP/PS1鼠异常的神经网络和神经元超兴奋脑片膜片钳记录各组小鼠兴奋性突触后电流（s EPSC）和神经元动作电位（AP）的差异。下调星形胶质细胞Nav1.6后,APP/PS1小鼠s EPSC的频率降低,s EPSC的幅度没有明显的改变但其分布变窄。此外,下调星形胶质细胞Nav1.6减少APP/PS1鼠AP的数量,并且提高其阈值。第二部分下调星形胶质细胞Nav1.6对APP/PS1鼠脑内的胶质细胞激活和Aβ沉积的影响2.1.下调星形胶质细胞Nav1.6减轻APP/PS1小鼠胶质细胞的激活APP/PS1鼠海马和皮层中,GFAP+和Iba1+的细胞面积在下调星形胶质细胞Nav1.6后减少,上述两种蛋白的表达也下调。APP/PS1鼠斑块周围的GFAP+和Iba1+细胞面积在下调星形胶质细胞Nav1.6后同样减少。此外,星形胶质细胞的突起总长度减少,小胶质细胞的突起总长度增加。说明下调星形胶质细胞Nav1.6减轻APP/PS1鼠整体水平和斑块周围胶质细胞的激活并且改善细胞的形态。2.2.下调星形胶质细胞Nav1.6减少APP/PS1小鼠Aβ斑块的沉积下调星形胶质细胞Nav1.6明显减少APP/PS1小鼠海马和皮层区域Aβ斑块的面积,还减少了海马区Aβ斑块的数量。2.3.下调星形胶质细胞Nav1.6减少APP、BACE1和s APPβ蛋白的表达APP/PS1鼠下调星形胶质细胞Nav1.6后,其APP、BACE1和s APPβ蛋白表达水平明显下降,提示下调星形胶质细胞Nav1.6后Aβ沉积减少是由于APP及其相关剪切蛋白表达减少导致的。第三部分下调星形胶质细胞Nav1.6抑制APP/PS1鼠Aβ生成的机制研究3.1.星形胶质细胞Nav1.6通过m TOR相关信号通路调控自噬-溶酶体途径3.1.1.下调星形胶质细胞Nav1.6促进APP/PS1鼠自噬下调星形胶质细胞Nav1.6促进APP/PS1鼠自噬溶酶体的形成,恢复了APP/PS1小鼠中自噬-溶酶体相关蛋白的表达。体外实验也证实,敲低星形胶质细胞Nav1.6促进Aβ刺激后星形胶质细胞自噬小体和溶酶体的融合,使其自噬溶酶体相关蛋白的表达正常化。3.1.2.下调星形胶质细胞Nav1.6调控AKT/m TOR/ULK信号通路下调星形胶质细胞Nav.6在APP/PS1小鼠中是通过AKT/m TOR/ULK信号通路,而不是通过ERK/m TORC信号通路调控自噬-溶酶体途径。体外实验也得出同样的结果。3.2.星形胶质细胞Nav1.6通过钠钙转换体/[Ca2+]i调控自噬-溶酶体途径3.2.1.Aβ刺激增加Nav1.6在星形胶质细胞上的膜表达以及钠电流Aβ刺激后星形胶质细胞Nav1.6的总蛋白没有明显改变,但膜蛋白表达增加,免疫荧光的结果也显示Nav1.6有往星形胶质细胞膜上迁移的趋势。Aβ刺激增强Nav1.6过表达的HEK293细胞的钠电流。敲低原代培养的星形胶质细胞Nav1.6后,细胞整体的钠电流减少,说明Nav1.6是星形胶质细胞上钠电流的重要组成部分,此外,Aβ刺激增强Nav1.6敲低的星形胶质细胞的钠电流,说明Aβ不仅仅作用于Nav1.6通道,还作用于钠通道的其他亚型。3.2.2.Nav1.6通过钠钙转换体调控胞内钙进而调控自噬在Nav1.6过表达的HEK293细胞中,胞内钙离子水平([Ca2+]i)增加,并且Aβ刺激后[Ca2+]i进一步增加,加入钠钙交换转运体抑制剂后,减少Aβ刺激的Nav1.6过表达细胞的[Ca2+]i。并且相较于普通的HEK293细胞,Nav1.6过表达细胞的钠钙交换转运体电流增加,Aβ刺激更是进一步加强上述电流,说明Nav1.6过表达增强钠钙交换电流增加[Ca2+]i。在Nav1.6敲除的星形胶质细胞中进行相同的实验,得到类似的结果,即Nav1.6敲除减少钠钙交换电流并且下调[Ca2+]i。结合在上述Nav1.6过表达细胞中得到的结果,说明Nav1.6通过钠钙转换体调控[Ca2+]i。此外,加入钙离子螯合剂EGTA后促进了Nav1.6过表达细胞的自噬水平,说明抑制[Ca2+]i能促进自噬。以上结果说明Nav1.6通过钠钙转换体调控胞内钙进而调控自噬。3.3.下调星形胶质细胞Nav1.6促进星形胶质细胞溶酶体融合APP敲除星形胶质细胞Nav1.6促进Aβ刺激后星形胶质细胞APP和溶酶体的结合,两者共定位增加,并且相关性和结合的数量也明显增加。此外,敲低星形胶质细胞Nav1.6能明显减少Aβ刺激后星形胶质细胞APP的表达,并且在此基础上再加入自噬小体抑制剂3-MA（5 m M）或溶酶体抑制剂CQ（40μM）后,上述现象得到逆转,说明下调星形胶质细胞Nav1.6通过促进自噬-溶酶体途径增强Aβ刺激后星形胶质细胞内源性APP的降解。实验结论:敲低星形胶质细胞Nav1.6改善APP/PS1小鼠认知功能和自噬流,减少胶质细胞激活与Aβ沉积,这可能与敲低星形胶质细胞Nav1.6减少钠钙交换电流减少[Ca2+]i,影响AKT/m TOR/ULK信号通路,增强自噬溶酶体途径,增加星形胶质细胞内源性APP降解有关。