论文部分内容阅读
成年猪的消化道内定植着数量庞大、种类繁多的微生物菌群,在营养物质代谢、免疫应答和生长发育等生物学过程中发挥重要作用。大量研究证实肠道微生物能调控脂质的消化、吸收和代谢,影响宿主不同组织的脂质代谢过程,调控脂肪在肝脏、皮下和肌肉等组织的沉积。在生猪生产中,皮下脂肪（Subcutaneous adipose tissue,SAT）含量和肌内脂肪（Intramuscular fat,IMF）含量是影响猪肉品质的重要因素,而猪肉品质作为重要的经济指标,直接影响消费者对猪肉的感官特性及肉制品的质量等级。莱芜猪是我国IMF含量高、肉品质好的优良地方猪种之一,其肠道微生物是改善商品猪肉品质的重要资源。本研究通过16S r DNA测序方法,比较研究了成年莱芜猪和杜×长×大商品猪肠道微生物组成和功能差异;利用粪便微生物移植技术（Fecal microbiota transplantation,FMT）,将健康莱芜猪粪便微生物移植给杜×长×大商品猪,研究肠道微生物对生长育肥猪脂肪沉积和肉品质的影响;结合多组学数据整合分析,筛选出调节脂肪沉积的关键差异微生物;关键候选菌株灌服SPF C57BL/6j小鼠解析其调控脂肪沉积的作用机理。主要研究内容和结果如下:1.比较研究莱芜猪和杜×长×大商品猪的肠道微生物组成和功能差异我们采集了健康成年莱芜猪和杜×长×大商品猪的粪便,通过16S r DNA测序分析,比较了其微生物组成差异,并通过PICRUSt分析,比较了其微生物组的功能差异。粪便微生物16S r DNA测序结果显示莱芜猪肠道微生物组成与杜×长×大商品猪有显著差异,莱芜猪肠道微生物多样性和丰富度均显著高于杜×长×大商品猪;莱芜猪中丰度最高的优势菌群为Bacteroidetes,其相对丰度显著高于杜×长×大商品猪（P＜0.01）;莱芜猪Firmicutes的相对丰度显著低于杜×长×大商品猪（P＜0.05）;PICRUSt分析结果显示次级代谢物的生物合成、氨基酸代谢、能量代谢和碳水化合物代谢相关的微生物在莱芜猪中显著富集。以上结果表明莱芜猪和杜×长×大商品猪的肠道微生物组成和功能差异显著,这可能是影响IMF含量的关键因素。2.粪便微生物移植试验研究微生物对猪肉品质和脂质代谢的影响我们将健康成年莱芜猪的粪便微生物移植给杜×长×大商品猪,以揭示肠道微生物与脂肪沉积和猪肉品质之间的关系。32头体重相近（29.6±0.18 kg）的杜×长×大仔猪随机分为四组,分别灌服无菌生理盐水（Control,Ctrl）、灭菌的粪便菌液（Sterilized fecal microbiota transplantation,SFMT）、10~7 CFU/m L的低浓度粪便菌液（Low-dose of fecal microbiota transplantation,LFMT）和10~8 CFU/m L的高浓度粪便菌液（How-dose of fecal microbiota transplantation,HFMT）,隔日灌服到出栏体重后屠宰采样。与Ctrl组相比,HFMT组背最长肌的IMF含量增加（P＜0.05）,背膘厚度降低（P＜0.05）;透射电镜和油红O染色结果显示HFMT组的肝脏脂肪沉积增加（P＜0.01）;小肠H＆E结果显示HFMT显著增加了十二指肠、空肠和回肠的绒毛高度,以及绒毛高度与隐窝深度的比值（P＜0.05）;气相色谱分析了粪便短链脂肪酸（Short chain fatty acids,SCFAs）含量,HFMT组的异丁酸和异戊酸含量显著高于Ctrl组（P＜0.05）。以上结果表明微生物具备调控猪IMF沉积和SAT沉积的能力,这种调控作用可能与微生物发酵产物SCFAs有关。整合微生物组学、脂质代谢组学和蛋白组学数据分析,筛选调节猪脂肪沉积的关键作用微生物。微生物组学数据结果显示,HFMT组的Bacteroides相对丰度显著增加,而Firmicutes的相对丰度降低,微生物组的结构更趋近莱芜猪,表明FMT成功重塑杜×长×大商品猪的肠道微生物组,使其具备莱芜猪的肠道微生物组成特性。为了确定脂肪沉积的增加是否与脂类代谢物的变化有关,我们整合小肠、血浆、肝脏和肌肉的脂质代谢组学数据,解析HFMT对不同组织脂质代谢的影响。结果发现HFMT可以显著提高肝脏和肌肉中脂肪酰基和甘油磷脂的表达水平,降低甘油酯类的表达水平。此外,小肠和肌肉的蛋白质组学数据表明,HFMT增加了脂肪合成相关的蛋白（FABP4、FASN、FADS1）的表达水平,降低了脂质代谢相关蛋白（ACADM）的表达水平。此外,结合微生物组和代谢组的相关性分析,我们筛选到4株（B.uniformis、S.globosa、H.saccharovorans和P.piscolens）调节猪脂肪沉积和猪肉品质的关键候选差异菌株。3.关键候选菌株灌服SPF小鼠解析其对脂肪沉积的调控机理我们分别用单个关键候选菌株或复合关键候选菌株接种SPF C57BL/6j小鼠,以解析关键候选菌株对脂肪沉积的影响和作用机理。结果表明,混合关键候选菌株灌服可以改善小鼠的IMF、体脂和SAT含量。P.piscolens灌服增加了小鼠的SAT、内脏脂肪（Visceral adipose tissue,VAT）和体脂含量,但对IMF含量无显著影响,表明微生物对脂肪沉积的调控具有组织特异性。混合关键候选菌株灌服增加小鼠肝脏中脂质代谢相关基因（Ppara、Cpt1a、Cpt1b和Pgc1a）和脂肪合成相关基因（Pparg和Dgat2）的表达水平（P＜0.05）,表明混合关键候选菌株灌服会促进小鼠肝脏脂质周转代谢。混合关键候选菌株灌服后的小鼠肌肉中脂质代谢相关基因的表达水平无显著变化,但脂肪合成相关基因（Cd36、Fasn、Acaca和Dgat2）的表达水平显著上调（P＜0.05）。以上结果表明混合关键候选菌株灌服能通过增加脂肪合成相关基因（Cd36、Fasn、Acaca和Dgat2）的表达水平来促进肌肉的脂肪沉积。综上所述,肠道微生物能调节生长育肥猪的肌内脂肪沉积,其作用机制是通过上调肌肉中的脂肪合成相关基因Cd36、Fasn、Acaca和Dgat2的表达促进IMF沉积。研究成果可为猪肉品质调控和新型功能微生物制剂研发提供重要的理论依据。