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研究背景:肝细胞肝癌是我国一种常见的消化系统恶性肿瘤。中国是乙肝病毒相关性肝炎高发国家,每年新增肝癌病例占全球50%以上。60岁以下男性中肝癌居恶性肿瘤发病率首位。肝细胞肝癌发病隐匿,病程极快,恶性程度很高。目前认为肝癌手术切除和肝癌肝移植是肝癌最有效的根治性手段,但预后较差,术后复发率较高,且仅有少数患者适合接受手术治疗,晚期肝癌及不可切除肝癌预后极差。因此,肝癌新型预后评判标志物和药物治疗靶标的研究至关重要。研究目的:本研究拟通过蛋白组学技术筛选肝癌及配对癌旁组织中的差异表达蛋白,在两个独立的临床队列中验证其表达及研究临床意义、预后价值。进一步在体内外实验中研究其功能,阐明其在肝癌进展中的作用机制,为新型肝癌预后标志物和肝癌药物治疗潜在靶点提供理论依据。研究方法:1.本研究首先收集15例原发性肝癌（首次接受手术治疗,未经过放化疗或TACE等治疗样本）及配对癌旁组织样本,通过同位素相对标记和绝对定量技术（isobaric tags for relative and absolute quantitation,iTRAQ）联合双向液相层析串联质谱（2D LC-MS/MS）筛选肝癌差异蛋白,针对筛选出的差异蛋白,使用TCGA数据库中肝细胞性肝癌mRNA-Seq数据集的50对肝癌及配对癌旁组织的mRNA数据作为队列1验证,本院收集的137例肝癌样本作为队列2,应用实时荧光定量PCR（qPCR）、Western blot免疫印迹、免疫组化等方法在队列2样本的肿瘤及配对癌旁组织中验证差异基因Human augmin complex submit 3（Haus3）的表达情况,并关联其与各项临床参数和预后相关性分析。2.应用人肝癌细胞系SMMC-7721和Bel-7402,使用siRNA和慢病毒对细胞系中Haus3表达水平进行干扰、过表达。通过流式检测细胞周期、凋亡,CCK8细胞增殖实验,裸鼠成瘤实验等检测Haus3对肿瘤细胞的各项功能的影响。针对Haus3影响肝癌细胞周期的现象进一步研究其潜在机制,通过GEPIA网站分析TCGA数据库中mRNA测序数据集,研究Haus3与细胞周期关键调控蛋白mRNA水平的相关性,通过Western blot检测相关蛋白表达及磷酸化水平,免疫荧光检测Haus3对纺锤体、中心体相关蛋白的影响,解释Haus3调控肝癌细胞周期的潜在机制。研究结果:1.ITRAQ技术结合2D LC-MS/MS技术检测肝癌及其配对癌旁组织鉴定出40个差异蛋白,包括30个蛋白在肝癌组织中高表达以及10个蛋白在肝癌组织中低表达。选取在肝癌组织中高表达且与癌旁配对组织相比差异倍数较大的Human augmin complex submit 3（Haus3）的基因进一步研究。TCGA数据库中肝细胞性肝癌mRNA-Seq数据集的50对肝癌及配对癌旁组织分析发现,Haus3（p<0.0001）在肝癌中高表达。肝癌组织Western blot、q-PCR及免疫组化检测证实,癌组织中Haus3表达升高,结合临床病理参数分析发现,肝癌组织中高表达的Haus3水平与肿瘤的大小（p=0.025）和数量（p=0.004）相关。同时,Kaplan-Meier分析发现Haus3高表达肝癌预示术后不良预后（p=0.001）,进一步进行单因素和多因素分析发现,Haus3及AFP≥20ng/ml是预后独立危险因素。根据AFP水平分组,在AFP≥20ng/ml的肝癌群体中,Haus3高表达仍与术后不良预后显著相关（p=0.001）。2.体内外研究发现Haus3过表达能增加肝癌细胞系增殖速率,敲低后肝癌细胞增殖减慢,且能抑制裸鼠移植瘤的生长;Haus3低表达未观察到细胞凋亡水平的统计学差异。Haus3低表达观察到肝癌细胞系G2/M期细胞百分比显著增加,过表达后在SMMC-7721和Bel-7402细胞系上得到对应的相反结果。GEPIA网站做Haus3与G2/M期相关周期调控蛋白的关联分析,发现Haus3的mRNA水平与PLK1、cdc25c、cdk1、CCNB1的mRNA水平存在正相关（相关系数分别是0.6,0.5,0.6,0.54）。检测蛋白原型和磷酸化蛋白发现,Haus3敲低能降低PLK1、cdc25c的磷酸化水平,增加cdkl的磷酸化和cyclin b1的表达。另一方面,免疫荧光和western blot发现Haus3敲低后降低中心体相关蛋白（α-tubulin）和微管相关蛋白（γ-tubulin）的表达。结论:1.本研究通过蛋白组学技术发现了一批肝癌差异表达蛋白,其中Haus3在肝癌组织中表达高于配对癌旁组织,与肝癌的大小、结节数量密切相关。高表达Haus3是肝癌早期预后独立危险因素。2.Haus3敲低后引起肝癌细胞G2/M期阻滞。Haus3通过PLK1的磷酸化及cdk1/cyclin B1复合体活性调节肝癌G2/M期转换,同时通过改变纺锤体相关蛋白的表达调节肝癌细胞进入有丝分裂期。3.Haus3有望成为肝癌术后预后评判的潜在分子标志物。