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骨骼肌占成年动物体重的40%～50%,是人体关键的发动器官,是肌肉骨骼系统不可缺少的组成部分。骨骼肌具有较强的再生能力,肌肉干细胞在骨骼肌再生过程中起关键作用。肌肉干细胞又名肌肉卫星细胞（satellite cells,SCs）在成年个体肌肉中位于肌纤维细胞膜和基膜之间,处于静息态[1]。肌肉受损伤时SCs被激活进入细胞周期,快速分裂产生大量成肌祖细胞（myogenic progenitor cells,MPCs）,MPCs分化形成新的肌管完成受损肌肉的修复[2]。应对轻微损伤（如肌肉拉伤,利器割伤等）肌肉干细胞在微环境（坏死肌纤维,胞外基质、间质细胞及生长因子等成分构成）调控下可以完成修复,然而在肌肉严重缺损（如手术切除）即肌肉大体积缺失（volumetric muscle loss,VML）时却不能完成修复,以致形成大量的疤痕组织[3-8]。目前临床对VML的传统治疗手段为自体移植和异体移植,这种方法不仅受免疫排斥和有限供体的限制且移植后受损肌肉几乎不能恢复到损伤前水平[9-11]。因此寻找新VML治疗手段及解析骨骼肌再生修复机制迫在眉睫。组织工程是一种单独或组合运用种子细胞、支架材料及生物活性分子修复或替代受损组织的交叉技术,这种技术对于VML的修复治疗有巨大潜力。然而当前关于骨骼肌再生修复机制知识的不足限制了肌肉组织工程种子细胞和支架材料的选择,培养条件的优化。胞外基质（Extracellular matrix,ECM）,生长因子及骨骼肌间质细胞构成了 SCs微环境[1]。骨骼肌ECM不仅为SCs和肌管提供了结合位点而且ECM中的糖蛋白利于生长因子前体的附着[12-14],为SCs感知外界机械力刺激和生长因子调控提供了有利环境。最近研究在骨骼肌中发现了多种间质细胞如SP细胞（sidepopulation cells）[15]、PW1+细胞[16]、成纤维成脂祖细胞（fibro/adipogenetic progenitor,FAPs）等。其中一些在肌肉发育和再生过程中起促进成肌作用,如成纤维成脂祖细胞（fibro/adipogenetic progenitor,FAPs）[17]、Tcf4+细胞[18]。然而骨骼肌 ECM 在体外是否依然能够发挥调控SCs的作用?在成肌过程中具有促成肌作用的骨骼肌间质细胞如何发挥作用?这些问题依然不清楚。基于以上问题,本研究的目的在于:（1）小鼠MPCs与骨骼肌ECM相互作用初步探究;（2）小鼠骨骼肌中快速贴壁细胞在成肌过程中的作用;（3）基于单细胞转录组测序解析小鼠骨骼肌细胞图谱及快速贴壁细胞在成肌过程中的作用机制。据此研究分为以下三个章节:第一章:小鼠MPCs与骨骼肌ECM相互作用初步探究为了探究骨骼肌ECM对小鼠MPCs生长分化的影响,本研究用大鼠骨骼肌脱细胞基质切片做为组织工程肌肉支架复合小鼠MPCs经分化诱导培养成组织工程肌肉束,通过成肌效果来检测ECM对小鼠MPCs成肌分化的影响。研究发现小鼠MPCs可以在骨骼肌脱细胞支架上贴附,生长和分化。然而,免疫荧光结果显示组织工程肌肉束成肌效率低,这提示虽然MPCs在骨骼肌再生过程中起到关键作用,但骨骼肌组织工程中只有MPCs和胞外基质及基本的成肌诱导分化环境还不够。第二章:小鼠骨骼肌快速贴壁细胞在成肌过程中的作用骨骼肌的再生是由多种细胞类型参与的过程,之前研究发现骨骼肌间质细胞,如成纤维成脂祖细胞（fibro/adipogenic progenitors,FAPs）[17]、Tcf4+细胞[18],在调节肌肉干细胞的分裂,自我更新及分化中起到重要作用。然而,肌肉中具有快速贴壁特点的细胞（rapidly adhering cells,RACs）在肌肉再生过程中的作用依然不清楚。在本章研究中,我们构建了骨骼肌类器官（skeletal muscle orgnoid）培养体系,在此体系中将RACs与MPCs共培养得到收缩功能的骨骼肌类器官,成肌分化标志蛋白-肌球蛋白重链（myosin heavy chain,MHC）免疫荧光染色发现RACs能够促进MPCs成肌分化时MHC的表达,骨骼肌类器官透射电镜结果显示RACs与MPCs共培养能促进MPCs分化时肌小节的形成,骨骼肌类器官生理功能量化Moveheat结果显示RACs与MPCs共培养得到的骨骼肌类器官抽动明显比MPCs单一培养组显著。上述结果显示骨骼肌类器官培养过程中,RACs能够显著提高MPCs分化成肌效率。同时我们在研究中首次构建的骨骼肌类器官培养体系为研究肌肉再生提供了新的体外研究模型。第三章:基于单细胞转录组测序技术解析小鼠骨骼成肌过程中的细胞亚群及细胞间的联系基于第二章骨骼肌类器官的研究我们发现小鼠RACs能够显著提高骨骼肌类器官培养过程中的成肌效率,但其中机制不清楚。为了回答这个问题,首先我们利用单细胞转录组测序技术手段解析了小鼠RACs的细胞类型构成,其中发现了一个新细胞类型:肌腱-成肌细胞。然后在单细胞转录组数据的基础上,通过受体-配体配对关系计算出小鼠RACs中的细胞亚群与小鼠MPCs的受体-配体关系热图。结果显示小鼠RACs分泌的胞外基质蛋白和生长因子（血管内皮生长因子vascular endothelial growth factor,VEGFA 和肝素结合 EGF 样生长因子 heparin-binding EGF-like growth factor,HBEGF）参与骨骼肌类器官的成肌过程。最后我们分别通过trans-well和小分子抑制剂阻断VEGF信号通路验证了小鼠RACs与MPCs的受体-配体关系计算的预测。本章研究将RACs分为7个细胞亚型并部分阐述了其促进骨骼肌类器官成肌的机制,为研究RACs在体内肌肉再生过程中作用提供了线索。