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目的:通过体外培养猪卵泡膜细胞,采用地塞米松诱导细胞产生胰岛素抵抗,高雄激素状态,构建出PCOS卵泡膜细胞模型。并从雄激素雄激素生成关键酶CYP17及其调控因子c-Fos与主要信号转导途径(MAPK/ERK)来研究养精种玉汤有效成分降低卵巢源性雄激素生成的分子机制。从而为养精种玉汤治疗多囊卵巢综合征高雄激素血症提供实验证据。 方法: 1.猪卵泡膜细胞的获取与培养:从屠宰场获取新鲜的猪卵巢组织带回实验室,选取直径4-6mm的优质卵泡(卵泡壁半透明、胞浆液呈淡黄色、清亮透明)直接刺破,充分释放出颗粒细胞后将卵泡膜翻转,用眼科镊子将颗粒细胞刮干净,然后将组织块完全剪碎后,用组织块培养法培养出原代细胞。 2.用含有1μmol/L地塞米松的培养基培养卵泡膜细胞48h,测定细胞上清液中葡萄糖和睾酮的变化。 3.ERK抑制剂最适宜浓度以及作用时间的摸索:用不同浓度的PD98059作用于细胞24h后,westurn blot检测各组ERK1/2蛋白的表达,获得最佳抑制浓度。用最佳浓度分别作用细胞不同的时间westurn blot检测各组ERK1/2蛋白的表达,获得最佳作用时间。 4.养精种玉汤有效部位对ERK信号通路的调节:用养精种玉汤有效部位刺激加或不加ERK抑制剂的卵泡膜细胞,培养24h后用westurn blot分别检测各组ERK1/2的表达。 5.养精种玉汤有效部位调节雄激素的分子机制:用养精种玉汤有效成分刺激已被地塞米松诱导成功的卵泡膜细胞,测定各组细胞ERK1/2、c-Fos、CYP17蛋白的表达和上清液中睾酮的变化。 6.统计学方法:所有数据均以均数±标准差(-x±s),采用 SPSS18.0统计软件进行t检验。P<0.05表示具有统计学差别。Western blot采用Image J进行图像分析。结果数据用GraphPad Prism5.0进行拟合。 结果: 1.24h后组织块贴壁良好,组织块边缘开始爬出卵泡膜细胞,细胞在培养的第3~4天达到增殖高峰,第7~8天以后逐渐衰老、凋亡。 2.用地塞米松诱导细胞后,模型组细胞上清液中葡萄糖和睾酮的浓度显著升高。 3.PD98059作用于细胞浓度为15μmol/L,作用时间为24h时,细胞中ERK1/2蛋白的表达最低。 4.用用养精种玉汤有效成分刺激已被PD98059抑制的细胞,细胞中ERK1/2蛋白的表达升高。 5.养精种玉汤有效成分正丁醇和乙酸乙酯提取物作用于上述细胞模型后, ERK1/2和c-Fos的表达升高,CYP17和睾酮的表达降低。 结论: 1.用组织块培养法可以成功培养出原代卵泡膜细胞。 2.地塞米松诱导细胞产生胰岛素抵抗、高雄激素的状态,造模成功。 3.养精种玉汤有效成分(正丁醇和乙酸乙酯提取部位)可以激活ERK信号通路。 4..养精种玉汤有效成分(正丁醇和乙酸乙酯提取部位)可能通过ERK/c-Fos/CYP17途径抑制雄激素的生成,从而为养精种玉汤有效成分(正丁醇和乙酸乙酯提取部位)治疗PCOS高雄激素血症提供了实验依据。