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异位妊娠（Ectopicpregnancy,EP）是指发生在子宫腔以外的妊娠,最易发生的部位在输卵管。目前EP诊断主要依赖于阴道超声检查,然而早早期的输卵管妊娠（Tuble ectopic pregnancy,TEP）由于异位包块太小在B超下尚不能被识别,此时需要生物标记物来辅助诊断EP。在妊娠早期,现临床常用的生物标记物为人绒毛膜促性腺激素（Human chorionic gonadotropin,HCG）和孕酮（Progesterone）,HCG 水平及增长趋势对EP诊断具有一定的提示作用。然而在系列的HCG检查等待确诊的过程中,异位妊娠包块不断向输卵管侵蚀,可能造成输卵管破裂,出现腹腔内大出血甚至导致患者死亡。目前被探索的EP生物标记物已有20余种,但这些标记物大都存在较高的假阳性或假阴性,诊断效果并不理想,也没有很好的应用于临床,并且这些标记物鉴别EP和自然流产（Spontaneous abortion,SA）也不理想。因此本实验设计了一个队列研究,收集有阴道流血或伴腹痛的早孕患者的血清,随访妊娠结局,对EP、SA和有活力的宫内妊娠（Viable intrauterine pregnancy,VIP）患者进行血清外泌体sRNA测序,筛选差异表达明显的miRNA进行qRT-PCR验证,联合孕酮及HCG水平进行关联分析,探索诊断EP的生物标记物。化瘀消癥颗粒是广州中医药大学第一附属医院院内制剂,是邓高丕教授带领的团队致力于输卵管妊娠临床与基础研究20余年的转化成果。MiR-184是团队前期在血清外泌体中测序得到的在EP患者差异表达明显的miRNA,并在血清外泌体及绒毛组织中得到验证。MiR-184在许多肿瘤中表达失调,而早期TEP滋养细胞的侵袭迁移行为和肿瘤细胞类似。因此,基于前期研究,本课题基础研究部分选用人绒毛膜滋养细胞HTR-8/SVneo为载体进行实验,研究miR-184介导的化瘀消癥颗粒杀胚机制。一、临床实验目的:基于筛选验证的血清外泌体miRNAs,结合患者血清HCG及孕酮水平,研究诊断早期EP的单个生物标记物及多重生物标记物组合。方法:通过二代高通量测序外泌体sRNA,以丨Fold Change |>1.5,p<0.01为阈值,组间两两对比,筛选EP、SA、VIP差异表达明显的miRNA进行qTR-PCR验证,联合孕酮及HCG水平进行关联分析,计算单个生物标记物及多重生物标记物组合的ROC曲线下面积（AUC）及固定敏感度为分别90%、95%时的特异度。结果:1.作为诊断EP的单个生物标记物,孕酮具有最大的AUC 0.777;固定敏感度为90%,miR-378d特异度最高为60%;固定敏感度为95%,miR-146a-5p特异度最高为36%。作为诊断EP的多重生物标记物组合,AUC有所提高,达0.801-0.889;固定敏感度为 90%,HCG+P+miR-146a-5p 及 HCG+P+miR-215-5p 特异度最高,均为 76%,和HCG+P比较,具有统计学差异（P<0.05）;固定敏感度为95%,HCG+P+miR-146a-5p敏感度最高,为40%,和HCG+P 比较,具有统计学差异（P<0.05）。2.作为鉴别诊断EP和SA的生物标记物,在单个生物标记物中,孕酮取得最高的AUC 0.746;固定敏感度为90%,miR-378d、miR-215-5p具有最高的特异度44.4%。在多重生物标记物组合中,HCG+P+miR-146a-5p亦取得较为理想的AUC 0.783;固定敏感度为90%,HCG+P+miR-146a-5p同时有最高的特异度66.6%,但和HCG+P 比较,无统计学差异（P>0.05）。二、基础实验目的:对比输卵管妊娠绒毛组织和正常宫内妊娠绒毛组织中miR-184的表达差异并探讨miR-184的功能;预测并验证miR-184的作用靶点,探讨化瘀消癥颗粒杀胚的药效及基于miR-184的杀胚分子机制。方法:1.组织验证通过qRT-PCR实验方法验证miR-184在卵管妊娠绒毛组织和正常宫内妊娠绒毛组织中表达差异。2.miR-184功能验证对 HTR-8/SVneo 细胞外源性的转染 miR-184 mimics、inhibitor 及对照对 miR-184进行过表达或抑制,通过qRT-PCR检测转染效率,CCK8实验检测细胞增殖,流式细胞技术检测细胞凋亡,划痕实验检测细胞迁移,transwell实验检测细胞侵袭,ELLISA检测细胞上清HCG变化。3.miR-184靶基因预测及验证通过TargetScan、miRDB、miRanda、CLIP生信分析预测miR-184的靶基因,根据mirSVR值结合文献及研究目的进行靶基因筛选。通过qRT-PCR及Western blot检测过表达或抑制miR-184 EPB41L5 mRNA及蛋白水平变化。通过双荧光素酶报告基因实验验证miR-184是否直接靶向EIPB41L5 mRNA的3’UTR端。SiRNA干扰分析沉默EPB41L5后是否能模拟miR-184过表达或抑制所引起的HTR-8/SVneo细胞侵袭迁移改变。4.化瘀消癥颗粒对滋养细胞HTR-8/SVneo增殖、侵袭、迁移及HCG表达的影响采用不同浓度的化瘀消癥颗粒干预HTR-8/SVneo细胞,通过CCK8实验检测细胞增殖,划痕实验检测细胞迁移,transwell实验检测细胞侵袭,ELLISA检测细胞上清HCG变化。5.化瘀消癥颗粒对HTR-8/SVneo细胞miR-184及靶基因EPB41L5表达的影响采用高、中、低剂量的化瘀消癥颗粒干预HTR-8/SVneo细胞,通过qRT-PCR检测 HTR-8/SVneo 细胞 miR-184 及 EPB41L5 mRNA 表达变化,Western blot 检测EPB41L5蛋白表达变化。结果:1.miR-184在卵管妊娠绒毛组织中呈低表达状态,与正常宫内妊娠绒毛组织比较,具有统计学差异（P<0.05）。2.转染 miR-184 mimics、miR-184 inhiitor 及 NC 48h,过表达组 HTR-8/SVneo 细胞miR-184水平上调,抑制组miR-184水平下调,与各自NC组比均有统计学差异（P<0.05）。过表达或抑制miR-184表达各组间HTR-8/SVneo细胞增殖、凋亡及上清HCG表达无明显差异（P>0.05）。转染后72h,miR-184过表达组细胞迁移距离减小,抑制组细胞迁移距离增大。转染48h,miR-184过表达组细胞穿膜个数减少,miR-184抑制组细胞穿膜个数增多,与对照组比较均有统计学差异（P<0.05）。3.①经生信分析预测miR-184的靶基因为EPB41L5。②Western blot实验显示转染后72h,miR-184过表达组HTR-8/SVneo细胞EPB41L5蛋白表达下调,抑制组EPB41L5蛋白表达上调,与NC组比较均有统计学差异（P<0.05）。qRT-PCR证实,同样方法干预72h后,EPB41L5 mRNA变化有同样的趋势（P<0.05）。③双荧光素酶报告基因实验证实miR-184直接作用于EPB41L5 3’ UTR端,从而抑制EPB41L5的表达。④SiRNA沉默EPB41L5 72h后,HTR-8/SVneo细胞迁移侵袭受到抑制。与Si-EPB41L5 NC组比较,Si-EPB41L5组穿膜细胞减少并有统计学差异（P<0.05）。4.①化瘀消癥颗粒可以抑制HTR-8/SVneo细胞增殖,并呈质量浓度和时间依赖性。和空白组比较,作用12h后化瘀消癥颗粒1,2g/L组细胞存活率有统计学差异（P<0.01）,作用24h、48h后化瘀消癥颗粒0.125,0.25,0.5,1,2g/L组细胞存活率有统计学差异（P<0.05）。相同浓度的化瘀消癥颗粒分别作用HTR-8/SVneo细胞12h、24h、48h,细胞存活率降低,0.25,0.5,1,2g/L组有统计学差异（P<0.05）。②化瘀消癥颗粒0.5g/L组可以明显抑制HTR-8/SVneo细胞迁移。③药物干预HTR-8/SVneo细胞24h,化瘀消癥颗粒0.4,0.5g/L组细胞穿膜个数减少,与NC组比较均有统计学差异（P<0.01）。与MTX组比较,化瘀消癥颗0.3 g/L、0.4 g/L组细胞侵袭数目较多,有统计学差异（P<0.05）,0.5g/L组侵袭细胞数减少,具有统计学差异（P<0.01）。④与空白组相比,化瘀消癥颗粒0.4,0.5g/L组β-HCG表达下调,差异有统计学意义（P<0.01）。MTX可以抑制HTR-8/SVneo细胞β-HCG的分泌,与空白组比较,差异有统计学意义（P<0.01）,与化瘀消癥颗粒0.3g/L组比较,差异有统计学意义（P<0.01）。5.①0.5g/L、0.4g/L、0.3g/L的化瘀消癥颗粒作用8h可以上调HTR-8/SVneo细胞miR-184表达,与.NC组比有统计学差异（P<0.05）。②0.5g/L、0.4g/L、0.3 g/L化瘀消癥颗粒作用HTR-8/SVneo细胞24h能降低细胞EPB41L5 mRNA及蛋白表达,与.NC组比较均有统计学差异（P<0.05）。结论:（一）临床实验1.在HCG、孕酮及6个候选miRNA单个标记物中,孕酮诊断EP具有最好的区分度,miR-378d特异度最高,但由于临床中孕酮诊断EP并不理想,因此本实验中单个标记物诊断EP效能不佳。在诊断EP的多重标记物组合中,不同组合的区分度相近,HCG+P+miR-146a-5p及HCG+P+miR-215-5P特异度最高,均为76%（固定敏感度90%）;固定敏感度为95%时,HCG+P+miR-146a-5p敏感度最高,为40%。2.作为鉴别诊断EP和SA的标记物,在单个生物标记物中,孕酮取得最高的AUC 0.746,miR-378d、miR-215-5P具有最高的特异度44.4%（固定敏感度90%）,其中miR-378d AUC较高,为0.684。多重生物标记物组合中,HCG+P+miR-146a-5p取得较为理想的AUC 0.783,同时有最高的特异度66.6%（固定敏感度为90%）。（二）基础实验1.miR-184在输卵管妊娠绒毛组织中表达下调。miR-184可以抑制HTR-8/SVneo细胞侵袭和迁移功能。2.生信分析预测并通过qRT-PCR、western及双荧光素酶报告基因等验证了EPB41L5为miR-184的功能性靶基因。3.化瘀消癥颗粒能抑制HTR-8/SVneo细胞的增殖、侵袭、迁移及HCG分泌功能。4.化瘀消癥颗粒能上调HTR-8/SVneo细胞中miR-184表达,下调靶基因EPB41L5表达。说明化瘀消癥颗粒可能通过调控miR-184抑制滋养细胞侵袭迁移从而发挥临床杀胚效应。