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研究背景:结肠癌（Colorectal Cancer,CRC）是常见的消化系统恶性肿瘤,其转移途径是淋巴转移,目前主要的治疗手段是外科手术加淋巴清扫,但结肠癌术中淋巴清扫存在一定的盲目性,导致肿瘤转移淋巴结（Lymph Node,LN）的残留,因此术中准确辨识肿瘤转移LN,对结肠癌病人的预后具有重要意义。研究目的:本研究构建了一种可以靶向结肠癌肿瘤细胞的显像探针—表面活性剂剥脱-曲妥珠单抗酞菁胶束（Surfactant Stripped-Trastuzumab Phthalocyanine Micelle,ss-TPM）,利用该探针能够在裸鼠结肠癌淋巴管中移行并特异性结合结肠癌肿瘤细胞的特点,实时显像诊断肿瘤转移LN。研究方法:1.ss-TPM的构建与表征:在表面活性剂普朗尼克F127（Pluronic F127,简称F127）表面修饰上羧基,利用其温度敏感的临界胶束浓度（Critical Micelle Concentration,CMC）,在低温离心的条件下得到表面活性剂剥脱-酞菁胶束（Surfactant Stripped-Phthalocyanine Micelle,ss-PM）;通过羧基和抗体表面的氨基进行缩合反应,同时标记荧光染料,从而制备了表面活性剂剥脱-曲妥珠单抗酞菁胶束（Surfactant Stripped-Trastuzumab Phthalocyanine Micelle,ss-TPM）;通过傅立叶变换红外光谱（Fourier Transform Infrared Spectrometry,FT-IR）、核磁（Nuclear Magnetic Resonance,NMR）对羧基化的F127进行表征,通过聚丙烯酰胺凝胶电泳（Sodium Dodecyl Sulfate-Polyacrylamide Gel Electrophoresis,SDS-PAGE）对曲妥珠单抗的连接及荧光染料的连接进行表征,通过透射电子显微镜（Transmission Electron Microscopy,TEM）和动态光散射（Dynamic Light Scattering,DLS）对ss-PM和ss-TPM的表面结构、粒径及Zeta电位进行表征,通过多功能酶标仪对ss-PM和ss-TPM的紫外吸收光谱及荧光光谱进行表征。2.结肠癌原位裸鼠模型的建立:通过将稳定转染荧光素酶的人结肠癌细胞HT-29-Luc细胞悬液注射到裸鼠盲肠浆膜下层,构建结肠癌原位裸鼠模型;利用生物发光成像（Bioluminescence Imaging,BLI）技术探索了腹腔裸鼠淋巴结的位置及各部位淋巴结转移的规律。3.ss-TPM的显像诊断:通过细胞内化实验证明ss-TPM的靶向性;尾静脉注射ss-TPM到裸鼠体内,通过荧光成像（Fluorescence Imaging,FRI）显像,观察原位肿瘤和淋巴结的发光情况,并通过BLI发光确认是否在同一部位,从而研究ss-TPM靶向的准确性。通过FRI观察ss-TPM在脏器中的分布。采用表面活性剂剥脱-人免疫球蛋白 G 酞菁胶束（Surfactant Stripped-IgG Phthalocyanine Micelle,ss-IPM）作为阴性对照。研究结果:1.ss-TPM的表征:FT-IR测定结果表明在1737.3 cm-1左右,羧基化的F127存在特征峰;NMR实验结果表明在2.6 ppm左右,羧基化的F127存在特征峰,说明本研究成功合成了羧基化F127;SDS-PAGE结果表明,曲妥珠单抗可以全部连接到ss-PM上,无游离抗体的存在;TEM和DLS结果表明,ss-PM与ss-TPM分别为20nm和30nm左右,且大量存在;多功能酶标仪测定结果表明,ss-TPM在600～800 nm有一定吸收,并且可以检测到标记有荧光染料的纳米粒。2.结肠癌原位裸鼠模型的建立:本研究发现HT-29-Luc细胞数目与BLI强度存在良好的线性关系（R2=0.99）;本研究通过台盼蓝示踪建立了裸鼠原位接种技术,在建立结肠癌裸鼠原位模型2周后,观察到原位肿瘤可以成瘤;通过解剖裸鼠确认了腹腔淋巴结的位置及重要脏器的分布,即胃小弯侧淋巴结（Gastric Lymph Node,GLN）、胰十二指肠淋巴结（Pancreaticoduodenal Lymph Node,PLN）、肠系膜淋巴结（Mesenteric Lymph Node,MLN）及腰椎淋巴结（Lumbar Lymph Node,LuLN）,并且通过病理切片进行了确认;本研究在模型建立后的第3～8周,通过BLI强度的不断升高,确认裸鼠结肠癌原位肿瘤是不断生长的;根据BLI观察了第3～8周裸鼠结肠癌模型的LN转移规律,从第3周开始,全部裸鼠均有LN转移,且转移部位均为MLN,第3～5周可见有1只裸鼠MLN出现从第一级淋巴结转移向次级淋巴结转移,第6～8周时,可见出现从第一级淋巴结转移向次级淋巴结转移,在第8周时,出现跳跃性转移。在观察过程中,除了 MLN其它部位暂无淋巴结转移;在远处转移中,第3～8周肝脏和肺脏较容易发生转移,脾脏发生一定程度上的转移,心脏和肾脏很少发生转移。3.ss-TPM的显像诊断:通过细胞内化实验表明ss-TPM可以靶向HT-29-Luc细胞;ss-TPM和ss-IPM通过尾静脉提前（2h、4h、8h、24h）注射到裸鼠体内并成像,根据荧光强度判断其在肿瘤和脏器中的分布以及LN靶向情况。靶向ss-TPM的荧光强度均比非靶向ss-IPM在肿瘤部位的荧光强度高,且4 h达到高峰;靶向ss-TPM可以准确靶向肿瘤转移淋巴结,且8 h达到高峰;而非靶向ss-IPM可以到达MLN和PLN,但存在过度显像和漏检的情况;对照组ICG可以到达淋巴结,但存在无肿瘤转移的淋巴结被点亮的情况。说明无论非靶向ss-IPM和ICG均无法准确靶向肿瘤转移淋巴结,靶向ss-TPM可以准确靶向肿瘤转移淋巴结。在不同的时间点肿瘤显像中,靶向ss-TPM在各重要脏器内均有所分布,主要分布在肝脏和肾脏中,且4h达到高峰。研究结论:1.本研究成功构建了表面活性剂剥脱-曲妥珠单抗酞菁胶束（ss-TPM）;2.本研究证实HT-29-Luc细胞的数目与BLI强度存在良好的线性关系,BLI强度的变化可以反映肿瘤的生长情况;3.本研究建立了裸鼠原位接种技术,成功建立裸鼠结肠癌原位模型,成瘤率100%,且随着时间的延长,肿瘤在不断生长;4.本研究确定了腹腔内LN的位置,明确了在裸鼠结肠癌原位模型淋巴结及脏器转移规律,第4～5周为理想的成像时间,即淋巴结存在转移而并无远处转移;5.本研究明确了 ss-TPM可以靶向HT-29-Luc细胞;ss-TPM可准确显像肿瘤及转移LN。