论文部分内容阅读
目的:探讨一氧化氮供体NO-2的抗多药耐药肿瘤活性、抑制肿瘤转移作用及相关机制。方法:（1）采用总一氧化氮（Nitric oxide,NO）检测试剂盒检测谷胱甘肽（Glutathione,GSH）对NO-2及JS-K释放NO的行为能力;采用流式细胞术及激光共聚焦检测孵育不同剂量和时间的NO-2后K562/A02和MCF-7/ADM细胞内NO含量变化。（2）采用MTT法检测NO-2对K562、K562/A02、MCF-7、MCF-7/ADM和7702的毒性作用;应用流式细胞术和激光共聚焦显微镜检测细胞内Mito SOX、JC-1、Annexin V-FITC/PI、MDC荧光强度的剂量依赖性变化,研究NO-2对细胞线粒体ROS（Reactive oxygen species）、线粒体膜电位、细胞凋亡、细胞自噬的影响;Western blot检测不同浓度的NO-2对耐药肿瘤细胞凋亡相关蛋白以及自噬相关蛋白的影响。（3）MTT法检测NO-2短期低剂量下对耐药肿瘤细胞存活率的影响以及长期不同剂量下与阿霉素（Adriamycin,ADM）的协同作用;Western blot检测短期不同剂量的NO-2对K562/A02和MCF-7/ADM细胞P-gp（P-glycoprotein）的影响;流式细胞术及激光共聚焦荧光显微镜检测短期不同剂量的NO-2及JS-K对其耐药肿瘤细胞内ADM以及罗丹明123（Rhodamine 123,Rh123）累积的影响;Na+K+-ATP酶试剂盒检测短期以及长期作用下NO-2及JS-K对耐药肿瘤细胞Na+K+-ATP酶活性的影响。（4）细胞划痕实验检测NO-2及JS-K对MCF-7/ADM细胞划痕愈合的作用;Transwell实验检测NO-2及JS-K对K562/A02和MCF-7/ADM耐药肿瘤细胞侵袭迁移的作用;采用Western blot检测NO-2、JS-K以及抑制剂对其耐药肿瘤细胞i NOS以及转移相关蛋白表达的影响。（5）用MCF-7/ADM细胞建立裸鼠乳腺癌耐药动物模型,检测不同组别裸鼠的瘤体积、裸鼠体重及脏器指数变化;HE组织染色检测心、肝、脾、肺以及肾组织的组织学变化;Western blot检测瘤组织的P-gp以及凋亡相关蛋白的表达变化;动物活体成像技术检测ADM在裸鼠瘤内的累积情况;血常规检测血液指标变化情况;用4T-1细胞建立BALB/c小鼠乳腺癌肺转移动物模型,检测不同组别小鼠的体重、肺转移结节个数以及脏器指数的变化;HE组织染色检测肺组织上转移结节的变化;Western blot检测i NOS及转移相关蛋白表达的变化。结果:（1）NO-2及JS-K在PBS溶液中随着GSH浓度的增加总NO释放量增加;在K562/A02及MCF-7/ADM细胞中NO-2可浓度依赖性增加NO的释放,且其释放具有时间依赖性,于6 h时达到顶峰。（2）NO-2及JS-K对各种不同种系的肿瘤细胞以及耐药肿瘤细胞都有较好的抗肿瘤效果;NO-2可剂量依赖性促进耐药肿瘤细胞线粒体ROS和细胞凋亡率增加、线粒体膜电位降低、P62和Beclin-1介导的细胞自噬激活。（3）短期低剂量下NO-2对K562/A02和MCF-7/ADM的毒性较小,对P-gp的表达无明显的影响,但可以增加ADM及Rh123在肿瘤细胞内的累积并降低Na+K+-ATP酶活性;长期毒性剂量下NO-2显著抑制了P-gp的表达以及Na+K+-ATP酶活性,细胞内ADM的累积明显增多,NO-2与ADM在1～50μM范围内具有良好的协同作用,其协同指数均小于1（CI＜1）。（4）NO-2抑制细胞划痕的愈合及侵袭迁移到下室的细胞数量,NO-2可显著降低转移蛋白i NOS的表达。（5）MCF-7/ADM异种移植瘤动物实验显示NO-2及JS-K均有较好的抗肿瘤作用,NO-2与ADM联合使用具有增效减毒作用;NO-2显著抑制了肿瘤组织内部的P-gp和凋亡蛋白Cleaved caspase-8、Bcl-2的表达、增加了Cleaved caspase-9、Bax蛋白的表达;动物肺转移模型实验表明NO-2可显著降低肿瘤的肺转移,并且预先给药组（（Pre）NO-2）肺结节数目更少,其机制可能与NO-2降低肺组织蛋白i NOS的表达进而抑制MMP-9和MMP-2的表达及增加TIMP-1和TIMP-2的表达有关。结论:（1）NO-2具有GSH敏感性释放NO的作用,通过NO产生氧化应激发挥抗耐药肿瘤作用。（2）NO-2在低剂量短时程下可通过抑制P-gp的活性逆转肿瘤多药耐药;高剂量长期时作用则通过抑制P-gp的表达和降低Na+K+-ATPase的活性,同时发挥其本身的细胞毒性作用,因此与ADM具有良好的协同抗耐药肿瘤作用。（3）NO-2可抑制肿瘤转移,其机制可能与i NOS的表达降低有关。