目前,脓毒症存在着患病率高、病死率高、治疗费用高的三高现象,脓毒症已经构成对人类健康的严重威胁和经济发展的巨大负担。它的发病是由于血中或病灶内细菌释放出大量内毒素(endotoxin)到血液中引起的一种病理生理表现。致炎刺激脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)等激活单核巨噬细胞释放S100A8/A9,释放到细胞外的S100A8/A9通过与细胞膜上的受体结合进一步激活单核巨噬细胞,引起大量炎症因子和粘附因子的表达和释放,导致并参与了包括脑组织、肺、胃肠道、关节、心脏、膀胱、前列腺等多种脏器的炎症损伤以及广泛的全身性炎症反应甚至死亡。因此,S100A8/A9作为重要的炎症介质在全身炎症反应过程中起重要作用,对于它与细胞膜上的受体的结合的研究可能为临床治疗提供理论基础和现实依据。1965年,Moore等人从牛的大脑组织中首次分离出一种神经系统特异性蛋白混合物,因为该类蛋白能够100%溶解在饱和硫酸铵(ammonium sulfate)中性溶液中,故称之为S100蛋白。S100家族是一类低分子量(9-14kD)的酸性蛋白质,是一类具有高度结构同源性的钙结合蛋白。该家族的大部分成员都包含了两个EF手型结构域,并且和金属二价阳离子有不同的亲和力。其结构中铰链区和羧基末端序列是该家族发挥功能的关键所在。大部分S100家族的成员都定位在鼠3号染色体或人类的1q21号染色体上。在目前发现的21个家族成员中,S100A8、S100A9是比较重要的两个,它可高选择性和高亲和性地结合Ca2+Zn2+等离子,从而引起其结构改变,使其与靶蛋白结合,调节靶蛋白的活性,具备细胞外和细胞内调节活性,参与细胞迁移、花生四烯酸代谢、骨髓细胞成熟等生物学过程。在钙离子不存在的情况下,S100A9可以与S100A8结合形成异源二聚体,而在钙离了存在时,S100A9可以与S100A8结合形成异源四聚体。有研究者认为S100A8/A9是某些炎症发生时的标记物,而且它们与肿瘤的生成和迁移也有关系。目前,对于S100A8/A9的靶蛋白的研究已逐渐成为热点,其中对于膜蛋白晚期糖基化终末产物受体(receptor for advanced glycation end product, RAGE)的研究较多,近些年已经有研究者认为S100A8/A9可能是通过RAGE诱发其下游信号通路,但是关于S100A8/A9与RAGE如何相互作用及其与金属二价阳离子的关系的研究却很少。RAGE是细胞膜表面免疫球蛋白超家族跨膜受体的成员之一,RAGE的编码基因位于6号染色体短臂Ⅱ型与Ⅲ型主要组织相容性复合物(major histocompatibility complex gene, MHC)基因之间。最早是Neeper等人从牛肺中获得的。它在正常人的肺、肾等器官也有存在,但表达低下,在糖尿病、阿尔兹海默病、动脉粥样硬化等疾病状态下,其表达显著增高。RAGE在单核巨噬细胞、血管内皮细胞、肾系膜细胞、神经细胞及平滑肌细胞等细胞中普遍表达。人RAGE由404个氨基酸组成,理论分子量为42.8kD,分别由较大的细胞外段(321个氨基酸残基)、跨膜段(19个氨基酸残基)及短的细胞内段(41个氨基酸残基)三个部分构成。可溶性RAGE (soluble RAGE, sRAGE)即RAGE胞外段,为配体结合部位,具有V型片段紧接两个C型片段的免疫球蛋白结构,V型片段还含有两个与N偶联的糖基化位点,这些对于RAGE分子结构的稳定性和特异识别配体的功能具有重要意义。RAGE虽然是由于与AGE相互作用被发现并因此得名,但其配体并不是一段简单的多肽,而是一个配体家族,包括晚期糖基化终末产物(advanced glycation end product, AGE)、高迁移率族蛋白B1(high mobility group boxl, HMGB1)、淀粉样β多肽(amyloid-P peptide)及S100家族成员(如S100B,S100P,S100A4,S100A6,S100A8/A9,S100A11-13)等。RAGE与配体的结合能够引起细胞内生物学功能的关键性改变,其中包括细胞增殖、迁移和炎性介质的产生,介导细胞内的应急损伤和应答反应,从而参与包括糖尿病慢性并发症、肿瘤、动脉粥样硬化、关节炎和神经退行性病变等一系列疾病的病理过程。随着对RAGE研究的不断深入,研究者们更加深刻地认识到,阻断RAGE与其配体的结合效应,对于这些疾病的预防和治疗有重要意义。很多蛋白是通过与蛋白-蛋白间相互作用,或是作为多蛋白复合物中的成份发挥作用,因此,了解蛋白质间相互作用对于研究生物信号通路及细胞内功能很重要。目前用于研究蛋白质间相互作用的方法包括酵母双杂交(yeast-two hybrid)、体外结合实验(in vitro binding)、免疫共沉淀(co-immunoprecipitation)、串联亲和纯化(tandem affinity purification, TAP)、质谱鉴定mass spectrometry)、蛋白芯片(protein chip)以及基于生物信息学(Bioinformatics)的分析方法等。GST pull-down实验是一个行之有效的验证酵母双杂交系统的体外实验技术,近年来越来越受到广大学者的青睐。其基本原理是将靶蛋白-GST融合蛋白亲和固化在谷胱甘肽亲和树脂上,作为目的蛋白亲和的支撑物,充当一种“诱饵蛋白”,目的蛋白溶液过柱,可从中捕获与之相互作用的“捕获蛋白”(目的蛋白),洗脱结合物后通过SDS-PAGE电泳分析,从而证实两种蛋白间的相互作用或筛选相应的目的蛋白,“诱饵蛋白”和“捕获蛋白”均可通过细胞裂解物、纯化的蛋白、表达系统以及体外转录翻译系统等方法获得。基于以上认识,本实验首先构建了GST纯化标签的S100A8,S100A9融合表达载体,该表达载体与实验室保存的His纯化标签的esRAGE融合蛋白表达载体在BL21(DE3)宿主菌诱导表达后,利用GST-BindTM树脂及Ni2+-NTA亲和树脂进行纯化,并得到相应大小的融合蛋白。接着利用体外pull-down实验验证了S100A8,S100A9与esRAGE蛋白的相互作用,以其初步了解S100A8/A9与RAGE相互作用的机制,为最终阐明某些疾病的发病机制及基因治疗打下基础。通过以上研究,我们得出以下结果：1.成功构建了pGEX-4T-hS100A8和pGEX-4T-hS100A9原核表达载体,并成功纯化了GST-hS100A8, GST-hS100A9, His-esRAGE和GST蛋白。2.通过体外结合实验检测到hS100A8蛋白和esRAGE蛋白间存在相互作用,且存在金属二价阳离子Ca2+和Zn2+的依赖性。3.通过体外结合实验检测到hS100A9蛋白和esRAGE蛋白间存在相互作用,且存在金属二价阳离子Ca2+和Zn2+的依赖性。本研究以GST pull-down体外结合实验为手段,初步探讨了S100A8、S100A9与RAGE相互作用的机制,验证其与金属二价阳离子Ca2+,Zn2+的依赖关系。该研究对于深入探讨S100A8/A9与其受体结合的机制具有重要意义,同时也将为临床内毒素血症的治疗提供新的理论依据。