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乙型脑炎病毒（Japanese encephalitis virus,JEV）是一种危害严重的人畜共患虫媒性病毒病病原。JEV感染严重威胁人类健康,引起脑部炎症和神经损伤;也危害养猪业发展,引起猪的繁殖障碍疾病,但其致病机制尚不清楚。近年研究显示,乙脑病毒蛋白与宿主蛋白间的相互作用对病毒吸附、基因组合成、病毒粒子组装与释放、天然免疫逃逸及诱导宿主机体保护性免疫等方面产生重要影响。JEV非结构蛋白NS3由Ser蛋白酶结构域和NTPase/RNA解旋酶结构域构成,具有三种酶活性,在病毒RNA复制、病毒粒子组装与释放及病毒致病性中发挥重要作用,是一个多功能蛋白。因此,研究NS3蛋白与宿主蛋白的相互作用对解析JEV复制和致病机制及开发抗病毒药物具有重要的科学意义。本研究主要围绕与NS3互作宿主蛋白的筛选与鉴定、宿主蛋白对JEV增殖的影响及分子机制的研究展开,具体内容如下:1.JEV NS3蛋白相互作用宿主蛋白的筛选为了研究与JEV NS3相互作用的宿主蛋白,将JEV RP9毒株NS3基因序列克隆入慢病毒表达载体获得重组质粒p TRIP-NS3-3Flag,该质粒和p TRIP-3Flag分别与辅助质粒共转染293T细胞,获得表达NS3慢病毒。将慢病毒转导293T细胞,构建稳定表达NS3细胞系293T-NS3。进而利用免疫沉淀（IP）结合质谱分析（LC-MS/MS）的方法筛选与NS3互作宿主蛋白,根据质谱分析结果,我们选取HSP40/Dna JA1、HSP40/Dna JA2和CKB展开研究。为了鉴定NS3与三个候选蛋白相互作用,进而构建了真核表达质粒HA-Dna JA1、HA-Dna JA2和HA-CKB,分别与p TRIP-NS3-3Flag共转染293T细胞。免疫共沉淀（Co-IP）和Western blot检测结果显示NS3与Dna JA1和Dna JA2发生相互作用,而不能与CKB互作。为了进一步确定Dna JA1及Dna JA2与NS3互作功能域,分别构建了Dna JA1和Dna JA2的截短突变体,将p TRIP-NS3-3Flag与截短体的表达质粒共转染293T细胞,30h后收集细胞样品进行Co-IP分析,结果显示NS3能够钓取全长Dna JA2和C端截短体。Dna JA1的结果与Dna JA2一致,表明Dna JA1和Dna JA2的C端结构域参与了与NS3的相互作用。2.Dna JA1及Dna JA2对JEV增殖的影响将Dna JA1及Dna JA2克隆入p TRIP-3Flag获得p TRIP-Dna JA1-3Flag和p TRIP-Dna JA2-3Flag,转染293T细胞24h后感染JEV（RP9,1MOI）,36h后收集细胞和培养上清液。通过Wetsern blot、RT-q PCR和病毒噬斑实验评价Dna JA1及Dna JA2对JEV增殖的影响。Western blot检测结果显示Dna JA2的表达能显著提高NS3的蛋白水平;RT-q PCR统计结果表明Dna JA2的表达组中JEV C基因拷贝数显著高于对照组（p＜0.01）;病毒噬斑统计结果表明过表达Dna JA2的细胞中JEV的病毒滴度显著增高（p＜0.01）。同时,Dna JA2对JEV增殖的促进作用呈剂量依赖效应。Dna JA1对JEV增殖的促进效应与Dna JA2表现一致。为了进一步确认Dna JA1和Dna JA2对JEV增殖的影响,利用慢病毒干扰系统获得稳定干扰Dna JA1或Dna JA2表达的293T细胞系。进而用1MOI的JEV感染,36h后收集细胞与上清,通过Wetsern blot、实时定量PCR和病毒噬斑法评价下调表达Dna JA1及Dna JA2后对JEV增殖的影响。结果显示,内源性蛋白Dna JA1与Dna JA2表达下调后,病毒蛋白NS3水平,C基因m RNA水平及病毒滴度均显著下降,与过表达Dna JA1和Dna JA2结果相反。进一步证实了Dna JA1和Dna JA2可以促进JEV增殖。3.Dna JA1及Dna JA2促进JEV增殖的分子机制NS3与NS5相互作用共同参与JEV复制复合体的形成,在JEV复制中发挥重要作用。本研究证实了Dna JA1和Dna JA2与NS3相互作用并促进JEV增殖。那么Dna JA1和Dna JA2与NS5是否也存在相互作用呢?通过正反向免疫共沉淀实验证实了Dna JA1和Dna JA2能与外源性NS5以及JEV感染293T细胞产生的内源性NS3和NS5发生相互作用。间接免疫荧光及激光共聚焦显微镜观察也证实Dna JA1及Dna JA2与病毒蛋白NS3、NS5及病毒基因组RNA（ds RNA）存在共定位。这些结果表明Dna JA1和Dna JA2可能参与JEV复制复合体的形成。为了评价Dna JA1及Dna JA2是否通过协同分子伴侣功能稳定JEV复制复合体中NS3、NS5蛋白表达水平进而促进JEV复制。首先分析Dna JA1和Dna JA2对NS3及NS5蛋白表达量的影响,结果显示过表达Dna JA1与Dna JA2时,NS3与NS5蛋白水平明显上调,且呈剂量依赖性。而下调内源性Dna JA1或Dna JA2表达会降低NS3及NS5蛋白表达水平。可见Dna JA1与Dna JA2帮助稳定JEV复制复合体中NS3和NS5蛋白表达水平。另外,过表达Dna JA1及Dna JA2降低NS3与NS5的泛素化水平,而干扰Dna JA1及Dna JA2表达提高NS3和NS5的泛素化水平。结果表明Dna JA1及Dna JA2稳定JEV复制复合体中NS3和NS5蛋白表达的机制是通过抑制NS3和NS5的泛素化修饰而抑制其降解。为了进一步探究Dna JA1与Dna JA2对NS3和NS5降解途径的影响,Western blot结果表明无论是转染NS3及NS5表达质粒或病毒复制子,还是感染JEV,用蛋白酶体抑制剂MG132处理细胞后NS3与NS5蛋白水平均上调。此外,Dna JA1和Dna JA2能够上调NS3和NS5蛋白表达。当用蛋白酶体抑制剂MG132和溶酶体抑制剂NH4Cl分别处理细胞后,只有MG132处理组中NS3与NS5蛋白水平升高。这表明Dna JA1及Dna JA2通过抑制NS3与NS5发生K48类型泛素化而通过泛素蛋白酶体途径降解,从而稳定JEV复制复合体。本研究结果表明,宿主蛋白Dna JA1和Dna JA2均与NS3和NS5发生相互作用且与病毒感染293T细胞过程中产生的NS3、NS5及ds RNA发生共定位。Dna JA1及Dna JA2通过抑制NS3和NS5发生泛素化而降解,稳定JEV复制复合体,进而促进JEV增殖。此外,Dna JA1可与Dna JA2发生相互作用。