【摘 要】
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阿维菌素类是目前应用最为广泛的抗寄生虫药物,此类药物在发挥积极作用的同时,部分药物会残留在畜禽及其产品中,严重危害了人的健康和生态安全。目前用于阿维菌素类药物残留检测的免疫学方法主要是ELISA方法,具有操作简单、灵敏度高、可靠及适用于大批量现场筛选等优点,广泛用于农兽药残留监测。本研究通过分子模拟软件SYBL-X 2.0和ChemBioDraw Ultra 12软件设计半抗原,然后经过半抗原的合
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阿维菌素类是目前应用最为广泛的抗寄生虫药物,此类药物在发挥积极作用的同时,部分药物会残留在畜禽及其产品中,严重危害了人的健康和生态安全。目前用于阿维菌素类药物残留检测的免疫学方法主要是ELISA方法,具有操作简单、灵敏度高、可靠及适用于大批量现场筛选等优点,广泛用于农兽药残留监测。本研究通过分子模拟软件SYBL-X 2.0和ChemBioDraw Ultra 12软件设计半抗原,然后经过半抗原的合成、完全抗原的合成和单克隆抗体制备技术,获得了阿维菌素类广谱性单克隆抗体,建立了间接竞争ELISA（ic-ELISA）方法,并应用于猪肉、猪肝、猪肾、牛肉和牛奶样品中该类药物的残留检测。主要研究内容包括以下几个方面:1.以阿维菌素（AVM）和伊维菌素（IVM）为原料,合成半抗原4"-HS-AVM/IVM和5′-HS-AVM,经质谱鉴定均合成成功,通过碳二亚胺（EDC）方法分别与匙孔蓝蛋白（Keyhole limpet,KLH）、牛血清白蛋白（Bovine serum albumin,BSA）和卵清白蛋白（Ovalbvmin,OVA）进行偶联,制备了完全抗原4"-HS-IVM-KLH/BSA/OVA、4"-HS-AVM-BSA/OVA和5′-HS-AVM-BSA/OVA,经紫外分光光度计鉴定偶联成功。2.将人工抗原4"-HS-IVM-KLH/BSA、4"-HS-AVM-BSA和5′-HS-AVM-BSA免疫6周龄雌性Balb/c小鼠,ic-ELISA方法监测小鼠血清效价和特异性。其中免疫原4"-HS-AVM-BSA所免小鼠均未产生特异性抗血清,免疫原5′-HS-AVM-BSA无免疫原性。当免疫原为4"-HS-IVM-KLH（A1）时,小鼠的抗血清对AVM具有较高的特异性。3.选择以4"-HS-IVM-KLH（A1）免疫小鼠的脾脏与SP2/0骨髓瘤细胞进行细胞融合,亚克隆,得到杂交瘤细胞株IVM/6D4,该细胞株的染色体数平均为100.25。采用体内诱生法制备单克隆抗体,经鉴定亚型为Ig G1。以4"-HS-AVM-OVA为包被原,IVM为竞争物,优化ELISA条件,建立了ic-ELISA方法,结果表明,包被原的最佳包被浓度为0.25μg/m L,该单克隆抗体的最佳稀释度为1:64000;标准曲线回归方程为:y=-0.461x+0.9674;IC50=10.4±0.82μg/L,线性范围2.5-40μg/L。标准曲线的板内和板间变异系数均小于15%,灵敏度为1.38μg/L。该抗体对阿维菌素、伊维菌素、埃玛菌素和埃普利诺菌素的交叉反应率分别为141.8%、100%、48.7%和51.2%。4.向猪肉、猪肝、猪肾、牛肉和牛奶样品中添加阿维菌素类4种标准溶液,使其终浓度为1×LOQ、2×LOQ和4×LOQ。样品经过简易处理后使用建立的ic-ELISA进行检测,结果表明该类药物回收率均在78.1%-110.5%,批内批间变异系数均小于13.8%。应用液相色谱串联质谱检测方法,对建立的阿维菌素类ic-ELISA检测方法的准确性进行验证,结果表明两种方法的相关性良好,相关系数为0.9957,由此可以说明本研究建立的ic-ELISA方法的检测结果切实可靠。5.对伊维菌素标准品进行4℃长期稳定性试验,抗原和抗体进行37℃加速稳定性试验。结果表明伊维菌素标准品、抗体工作液及包被原均能在常规储存条件下稳定保存1年。本研究制备了一种能够同时识别4种阿维菌素类药物的单克隆抗体,交叉反应率较好,基于该抗体建立了猪肉、猪肝、猪肾、牛肉及牛奶中阿维菌素类的ic-ELISA检测方法,该方法的样品前处理与目前报道的样品前处理相比,具有操作步骤简单,节约有机试剂,重复性好,回收率高等优点。同时本研究为阿维菌素多残留检测试剂盒的研发奠定了基础,具有一定的学术价值和应用前景。
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