论文部分内容阅读
目的:我国是食管癌(Esophageal Carcinoma,EC)的高发地区,每年因食管癌死亡者大约15万人,约占全部恶性肿瘤死亡数的近四分之一。我国食管癌人口死亡率最低的为云南省(105/10万),与死亡率最高的河南省相差31倍,可见食管癌的发病率存在明显的地域差异。近年来,环境致癌因素(如真菌毒素、病毒等)在各类肿瘤的发生发展中已成为研究热点之一。人类乳头瘤病毒(Human papillomavirus HPV)与食管癌发生的关系最早是1982年由Syrjanen提出,他的研究发现40%(24/60)的食管癌发生的组织学形态改变与生殖道湿疣改变极其相似,随后他与同事用免疫组织化学法在食管鳞状上皮细胞癌(Esophageal squamous Cell Carcinoma,ESCC)中发现了HPV的结构蛋白。HPV作为重要致癌因素在宫颈癌发生中的作用已得到证实。随着研究的深入,有学者发现口腔、食管鳞状细胞癌的发生还与HPV感染有关。2008年,WHO认定HPV感染与人口咽部鳞状细胞癌发生存在直接关系。然而HPV与食管鳞状细胞癌的发生关系及其作用尚未阐明。Fas属于肿瘤坏死因子和神经生长因子受体家族成员,当Fas与它相应配体Fas L(CD95L)结合后,Fas受体三聚体化而活化,激活的受体与FADD结合,再与caspase-8相互作用使后者活化,形成死亡诱导信号复合物,再激活一系列的Caspase-1,3,7等,其中Caspase-3的切割底物为PARP,调控凋亡最终步骤的执行。FADD作为Fas通路的关键蛋白,可以触发凋亡级联反应。研究发现在人结肠腺癌细胞系HCT116细胞中高表达HPV16 E6,可以通过影响TRAIL蛋白介导的凋亡信号途径,避免宿主细胞凋亡。研究还发现HPV E6蛋白可以诱导FADD和caspase-8的泛素化,从而抑制Fas信号通路的激活来抑制细胞凋亡的发生。我们在前期实验中已经了解到HPV感染可以降低食管鳞状细胞癌中Fas蛋白的表达,为进一步明确HPV在食管鳞状细胞癌发生发展中的作用,本研究首先明确我省食管鳞状细胞癌组织中FADD、caspase-8蛋白的表达情况,分析HPV感染与FADD、caspase-8蛋白表达的关系,其次对正常食管上皮细胞和高分化食管鳞状细胞癌细胞株转染携带HPV16 E6基因片段的质粒,在过表达E6蛋白的情况下观察Fas/Fas L凋亡通路相关蛋白(Fas/Fas L、FADD、caspase-8)的变化情况。在整体水平和细胞水平探讨HPV对Fas介导的细胞凋亡通路相关蛋白的影响,从细胞凋亡角度进一步阐明HPV与食管癌发生的关系及其作用机制,为食管癌发生的病毒学机制的研究提供新的思路和视角,为食管癌的临床治疗、预后判断和预防提供科学依据。方法:1标本收集收集河北医科大学第二医院2009年1月到2015年12月间符合条件的食管鳞状细胞癌(原发性食管鳞状细胞癌,手术前未经放疗和化疗)的石蜡标本,共159例。收集临床病理资料,包括年龄,性别,淋巴结转移情况和癌组织的分化程度。2检测病毒DNA将石蜡组织切成薄片,使用石蜡组织DNA提取盒提取组织DNA。以HPV L1基因MY09/MY11为引物,用PCR方法检测各实验组与对照组中HPV L1基因的存在。使用β-actin作为内参,使用三蒸水代替引物完成PCR反应,作为阴性对照,使用确诊HPV阳性的宫颈癌石蜡组织提取的DNA作为阳性对照。3检测食管鳞状细胞癌组织的FADD、caspase-8蛋白表达情况应用免疫组化SP法检测食管鳞状细胞癌组织中FADD、caspase-8蛋白表达情况,FADD、caspase-8蛋白阳性反应均定位于细胞质。4 EX-GS3066-M90(HPV16 E6)、EX-NEG-M90(空载)质粒提纯及浓度检测。5 HPV16 E6质粒转染对体外培养的Het-1A(人正常食管上皮细胞)和Eca-109(人食管高分化鳞状细胞癌株)的Fas介导凋亡通路相关蛋白(Fas/Fas L、FADD、caspase-8)的影响体外培养Het-1A和Eca-109,转染HPV16 E6质粒和空载质粒(阴性对照),应用半定量RT-PCR、Western blot方法分别检测两组Het-1A和Eca-109细胞FADD、caspase-8的m RNA和蛋白表达变化情况,分析HPV16 E6蛋白对Fas凋亡通路的可能影响和机制。为了进一步明确HPV16 E6对人食管正常上皮Fas介导的凋亡通路的影响,转染Het-1A后于12h、24h、48h收集细胞,观察细胞内Fas/Fas L、FADD和caspase-8蛋白表达在转染后的变化趋势。6统计分析所有数据采用SPSS19.0软件,计数资料采用χ2检验及Pearson相关分析法,P<0.05认为差异有统计学意义。计量资料以均数±标准差((?)±s)表示,单因素方差分析P<0.05时认为差异有统计学意义。结果:1.1食管鳞状细胞癌(ESCC)病理形态学观察结果与临床病理分析本组ESCC病例共159例,年龄跨度为27-87岁,中位数为62岁;男性患者124例,女性患者35例;经病理形态学观察:淋巴结转移患者47例;ESCC高分化患者39例,中分化72例,低分化48例。低分化组与高中分化组的淋巴结转移率无明显差异(P>0.05)。1.2 ESCC组织中HPV的感染情况与临床病理特征的关系159例ESCC的HPV感染率为32.1%。HPV阳性组高中分化鳞癌占56.9%,明显低于HPV阴性组的75.9%;HPV阳性组低分化鳞癌占43.1%,明显高于HPV阴性组的24.1%(P<0.05);HPV感染与年龄,性别,淋巴结转移之间无明显差异(P>0.05)。2免疫组化结果2.1 ESCC组织中FADD、caspase-8蛋白表达情况159例ESCC组织中FADD蛋白表达阳性81例,阴性78例;caspase-8蛋白表达阳性93例,阴性66例。癌旁组织中FADD蛋白表达阳性150例,阴性9例;caspase-8蛋白表达阳性131例,阴性28例。FADD和caspase-8在ESCC组织中蛋白表达的阳性率分别为50.9%和58.5%,明显低于癌旁组织的94.3%和82.4%(P<0.05)。2.2 ESCC组织中FADD、caspase-8蛋白表达与HPV的关系HPV阳性组FADD蛋白表达阳性19例,阴性32例,caspase-8蛋白表达阳性24例,阴性27例;HPV阴性组FADD蛋白表达阳性62例,阴性46例;caspase-8蛋白表达阳性69例,阴性39例,FADD和caspase-8在HPV阳性组蛋白表达的阳性率分别为37.3%和47.1%,明显低于阴性组的57.4%和63.9%(P<0.05)。2.3 ESCC组织中FADD和caspase-8蛋白表达与临床病理特征的关系男性FADD蛋白表达阳性率为59.7%,明显高于女性的20.0%(P<0.05);FADD蛋白表达与年龄,淋巴结转移及肿瘤分化程度之间无明显差异(P>0.05)。男性caspase-8蛋白表达阳性率63.7%,明显高于女性的40.0%(P<0.05);caspase-8蛋白表达与年龄,淋巴结转移及肿瘤分化程度之间无明显差异(P>0.05)。2.4 HPV与FADD和caspase-8蛋白表达与临床病理特征的关系HPV感染阳性的ESCC组织:62岁以上(包括62岁)患者FADD蛋白阳性表达率24.1%,明显低于62岁以下患者的54.5%(P<0.05);低分化组FADD蛋白阳性表达率为13.6%,明显低于高中分化的55.2%;FADD蛋白表达与性别和淋巴结转移之间无明显差异(P>0.05)。HPV感染阳性的ESCC组织:低分化组caspase-8蛋白阳性率为27.3%,明显低于高中分化组的62.1%(P<0.05),caspase-8蛋白表达与年龄,性别和淋巴结转移之间无明显差异(P>0.05)。3细胞实验转染后HPV16 E6、Fas、Fas L、FADD、caspase-8蛋白表达情况3.1 RT-PCR结果显示:Het-1A细胞转染E6基因后与空载质粒组相比,E6基因相对表达升高(P<0.05);FADD、caspase-8基因相对表达量降低(P<0.05);Fas基因相对表达量升高(P<0.05);Fas L无明显变化(P>0.05)。Eca-109细胞转染E6基因后与空载质粒组相比,E6基因相对表达量升高(P<0.05);FADD、caspase-8、Fas基因相对表达量升高(P<0.05);Fas L无明显变化(P>0.05)。Het-1A细胞转染E6基因后与空载质粒组相比,E6基因在12h、24h和48h相对表达量呈上升趋势(P<0.05);FADD和caspase-8基因在12h、24h和48h相对表达量呈下降趋势(P<0.05);Fas基因在12h、24h和48h相对表达量呈上升趋势(P<0.05);Fas L无明显变化(P>0.05)。3.2 Western blot结果显示:Het-1A细胞转染E6基因后与空载质粒组相比,E6蛋白相对表达升高(P<0.05);FADD、caspase-8、Fas蛋白相对表达量降低(P<0.05);Fas L无明显变化(P>0.05)。Eca-109细胞转染E6基因后与空载质粒组相比,E6蛋白相对表达量升高(P<0.05);FADD、caspase-8、Fas蛋白相对表达量降低(P<0.05);Fas L无明显变化(P>0.05)。Het-1A细胞转染E6基因后与空载质粒组相比,E6蛋白在12h、24h和48h相对表达量呈上升趋势(P<0.05);FADD和caspase-8蛋白在12h、24h和48h相对表达量呈下降趋势(P<0.05);Fas蛋白在12h和24h相对表达量升高(P<0.05),在48h相对表达量降低(P<0.05);Fas L无明显变化(P>0.05)。结论:1本组食管鳞状细胞癌组织HPV的检出率为32.1%,HPV阳性的癌组织中低分化鳞状细胞癌所占比例高于HPV阴性组,提示HPV与肿瘤分化存在相关关系。2食管鳞状细胞癌中FADD和caspase-8蛋白表达降低,而且HPV可进一步降低两者的蛋白表达水平。3 HPV16 E6基因可以降低Het-1A和Eca-109细胞FADD、caspase-8、和Fas蛋白表达水平。4组织学和细胞学水平研究结果提示,HPV可能通过抑制FAS介导的凋亡通路,在食管鳞状细胞癌发生发展中发挥一定作用。