牡丹(Paeonia suffruticosa)、芍药(Paeonia lactiflora)杂交种胚转录组分析及SSR的开发利用

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牡丹(Paeonia suffruticosa)、芍药(Paeonia lactiflora)是我国传统的观赏植物,其远缘杂交后产生的杂种兼具二者优势而更具观赏价值。杂交作为育种界的主要技术手段,是培育新品种的一个重要途径。但远缘杂交后容易出现受精前障碍与受精后障碍的现象,造成种胚败育,最终导致结实率严重下降。已有的研究大部分都集中在生理生化水平的研究上,而对其杂交败育的分子水平机理仍不清楚。为了探究牡丹、芍药杂交种胚在受精后的种胚败育导致结实率下降的分子机理,本试验利用牡丹品种‘凤丹白’作母本,芍药品种‘粉玉奴’作父本杂交,对杂交后种胚败育的三个关键时期(前、中、后期)进行转录组测序分析,从中分析挖掘出与种胚败育相关的生物学资源,揭示败育相关性状的差异表达基因与其可能的调控机制。并对转录组数据分析的研究结果如下:1.使用BGISEQ-500平台对牡丹、芍药杂交种胚转录组进行测序,一共测了92.02 Gb数据。组装并去冗余后得到86 195个Unigene,总长度、平均长度、N50以及GC含量分别为102 497 172 bp、1 189 bp、1 780 bp和41.10%。然后将Unigene比对到七大功能数据库进行注释,最终分别有49 172(NR:57.05%)、38 352(NT:44.49%)、36 477(Swiss Prot:42.32%)、38 905(KOG:45.14%)、37 993(KEGG:44.08%)、26 832(GO:31.13%)以及37 758(Pfam:43.81%)个Unigene获得功能注释。使用Transdecoder检测出42 761个CDS。同时还检测出21 998个SSR分布于17 567个Unigene中,以及预测出1 671个编码转录因子的Unigene。2.在牡丹、芍药杂交种胚转录组中共筛选到32 961个差异表达的Unigene,其中上调基因有18 944个,下调基因有14 017个。进一步的GO功能注释分析发现,大量的差异基因均富集到了植物细胞生长发育、信号传导、糖脂类代谢、细胞分裂分化等方面。对三个时期的所有差异基因进行分析,共获得314个转录因子,分为17个转录因子家族。WRKY家族、b HLH家族、AP2/EREBP家族、ARF家族、C2H2家族、C3H家族等的差异基因在胚珠发育的三个时期均表现为上调的趋势,所鉴定的这些转录因子在种胚发育过程中存在的差异表达可能会导致最终的败育。对8 727个显著差异基因代谢通路注释分析,共富集到134条通路,其中显著富集的Pathway有37条主要富集在植物激素信号转导、植物MAPK信号通路、苯丙烷类生物合成、氨基糖和核苷酸糖代谢、内质网的蛋白质加工、淀粉和蔗糖代谢等代谢通路。3.对牡丹、芍药杂交胚败育相关代谢通路及涉及基因功能分析发现,植物激素信号转导途径中蛋白磷酸酶2C与乙烯反应转录因子1可能在败育胚珠中更活跃。对泛素介导的蛋白质降解差异基因分析发现,泛素活化酶的下调与泛素结合酶上调的不协调表达可能会使泛素/26S蛋白酶系统紊乱从而导致胚珠败育。在糖酵解/糖异生代谢途径中,丙酮酸脱氢酶和脱氢酶的下调表达可能破坏原有细胞体内的平衡,影响种胚内部的物质合成与能量代谢,从而导致种子败育。抗坏血酸和新陈代谢途径中,GDP-甘露糖-3’,5’-差向异构酶与抗坏血酸过氧化物酶的下调表达能导致胚珠败育。在谷胱甘肽代谢途径中分析发现,谷胱甘肽还原酶的高度上调表达破环了抗坏血酸—谷胱甘肽的循环,谷胱甘肽过氧化物酶的下调表达破坏了氧化型谷胱甘肽环境,打破原机体平衡的氧化还原环境,从而有可能导致种胚败育。4.本研究基于转录组数据从54对牡丹、芍药杂交种胚SSR引物中共筛选出21对稳定性好、有良好多态性的引物。结果表明,在17 567条Unigene中共检测到21 998个SSR位点,平均每4.66 kb就有一个SSR位点序列,发生频率为25.52%,其中单核苷酸重复、二核苷酸重复和三核苷酸重复为主要SSR位点类型且单核苷酸重复>二核苷酸重复>三核苷酸重复。基于牡丹、芍药杂交种胚转录组数据共得到试验材料的SSR位点的有效等位基因的平均值为6.7,香农指数的平均值为1.467,观测杂合度的平均值为0.5853,期望杂合度的平均值为0.677,多态性信息含量的平均值为0.6423。综合分析牡丹、芍药杂交种胚SSR标记具有丰富的多态性,在芍药属植物的遗传多样性分析中具有重要意义,为芍药属杂交育种、杂交种鉴定和亲缘关系的研究奠定了一定的基础。
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