远缘杂交育种是提高植物观赏价值、培育园艺新品种的重要及主要途径,但目前,牡丹、芍药间的杂交不亲和仍然是二者远缘杂交育种工作的重大障碍。近年来,相关研究也涉及到牡丹、芍药远缘杂交不亲和性方面,研究发现其关键原因是受精前障碍。在本课题组以往研究中,已明确牡丹、芍药受精前障碍相关具体情况与其出现的关键时间。本研究在前期工作的基础上,通过转录组测序技术,挖掘杂交不亲和的关键差异基因,进一步结合牡丹、芍药远缘杂交授粉后不亲和柱头差异蛋白组学数据,进行定量分析深入研究。研究结果将揭示牡丹、芍药远缘杂交不亲和障碍的分子机理,为研究二者远缘杂交中不亲和重要基因的筛选以及表达差异提供基础,并为克服远缘杂交障碍、促进牡丹种质创新提供理论基础。主要研究结果如下:1.转录组数据分析本研究利用RNA-Seq技术分析牡丹、芍药远缘杂交授粉后不亲和过程中柱头数字表达谱变化,首次对牡丹、芍药远缘杂交授粉后不亲和柱头进行了大规模基因表达的检测,根据转录组测序结果,共获得1,178.91Gb Clean Reads序列,包含10.29 Gb的碱基,其中GC%含量为41.17%。使用Trinity软件对Clean Reads进行组装,然后用TGICL软件进行聚类并去冗余,得到了总长度为98,693,005的131,265条Unigene序列。进行基因结构分析,以及CDS预测和SNP分析,通过NR、NT、Swiss-prot、KEGG、KOG和GO数据库对基因进行功能注释,共获得131,265条Unigene的注释结果,其中被注释到NR数据库的有45,943条,被注释到NT数据库的有35,181条,被注释到Swissprot数据库的有33,186条,被注释到Pfam数据库的有33,828条,被注释到KEGG数据库的有34,854条,被注释到KOG数据库的有35,864条,被注释到GO数据库的有24,594条,其中多数基因可划于44个功能条目、25个蛋白族和256条KEGG途径。2.差异基因分析及验证符合筛选条件的差异表达基因5,343个,与亲和的柱头相比,不亲和的柱头中差异表达的基因分别参与诸如蛋白质代谢、转运、转录调节、氧化还原、防御应答和信号传导等代谢过程。不亲和组通过调节防御应答相关的转录因子、ATP合成通路与质膜形成差异基因表达等协同作用,响应由杂交不亲和导致的胁迫。结合转录组数据与课题组已知的牡丹、芍药远缘杂交授粉后不亲和柱头差异蛋白组学数据,使用q RT-PCR技术对12个与不亲和相关差异基因的RNA-Seq结果进行验证,并对其相应蛋白进行蛋白质互作（PPI）网络分析。相关代谢通路涉及RNA降解、钙信号途径、MAPK信号途径、磷脂酰肌醇信号系统途,各通路中的差异基因表达出现在不亲和授粉后,花粉管生长需要的能量合成受阻,花粉管极性生长,相关信号通路和代谢途径受阻,其中烯醇酶、热休克蛋白、钙调蛋白、腺苷酸转运酶表达整体呈现下调。3.SSR分子标记开发基于牡丹转录组数据,进行SSR分子标记开发,为芍药属植物遗传多样性探究提供分子标记。本研究利用Misa软件对转录组数据进行SSR信息分析,并开发引物。通过PCR扩增,进行了引物多态性分析。结果表明,从转录组测序获得的131,265条Unigene中进行筛选,共获得44,181个SSR位点,分布于38,316条Unigene中,SSR的发生频率和平均分布距离分别为29.19%和2.23 kb。单、二和三核苷酸为优势重复类型,分布占SSR总数的75.19%、15.02%和6.88%。依据转录组中的SSR信息序列,随机合成60对引物在16份牡丹品种中进行多态性扩增,其中15对引物表现出多态性,各个位点等位基因数为4-13个,平均等位基因数8.13个,观测杂合度Ho、期望杂合度He、香农多样性指数I、多态信息含量PIC的平均值分别是0.7578、0.7903、1.7186和0.7308。进一步分析表明本试验转录组数据能够提供丰富的SSR位点,为牡丹遗传多样性分析和分子标记辅助选择提供更丰富可靠的标记选择。