二球悬铃木表皮毛相关基因PaGIS3、PaZFP6、PaZFP8的克隆与功能验证

来源 :华中农业大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:lxlhenhao
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二球悬铃木作为优质行道树,广植于世界各地。但每年四五月份其落果飞毛问题总会为人诟病,此问题至今未能从根本上解决。二球悬铃木的“飞毛”归根结底是表皮毛,包括不分支的腺毛和分支的非腺毛。植物的表皮毛在模式植物拟南芥和烟草中研究较多,发育过程和调控机理已有明确报道,而二球悬铃木目前尚无高效的转化体系,与二球悬铃木表皮毛相关的报道为数不多。为解析二球悬铃木表皮毛发育机理,本研究在模式植物拟南芥和烟草中验证了二球悬铃木表皮毛发育相关基因的功能,以期为培育出无球无毛的“完美型”悬铃木提供可用的理论依据。研究结果如下:1.结合表皮毛转录组数据和同源克隆,我们分离得到了PaGIS3、PaZFP6、PaZFP8基因,进化树结果显示,PaGIS3与葡萄的Vr GIS3距离最近,PaZFP6与荷花的Nn ZFP6亲缘关系最近,PaZFP8与荷花的Nn ZFP8亲缘关系最近,三者均为典型的C2H2型锌指蛋白类GIS亚家族基因,具有典型的QALGGH保守结构域。2.不同部位表皮毛的RT-PCR结果显示,PaGIS3在嫩枝(带毛嫩枝和去毛嫩枝)、心皮毛和根中表达量最高;PaZFP6在各个部位均有表达,而以嫩枝(带毛嫩枝和去毛嫩枝)、心皮毛和根的中表达量居高;PaZFP8在花序轴毛和心皮毛中表达量最高;YFP实验结果显示PaZFP6和PaGIS3定位于细胞核,而PaZFP8基因在细胞核和膜中均有表达。3.在拟南芥中超量表达PaGIS3和PaZFP6使得拟南芥主茎花序上表皮毛增多,萼片上表皮毛数量明显增加,且35S::PaGIS3转基因拟南芥主茎第三节间的表皮毛数量显著增加,并产生异位心皮毛。但PaZFP8在拟南芥中超量表达并未引起拟南芥表皮毛异常。根据已有文献报道,结合下游基因的表达结果,选定AtGIS和AtGIS2作为PaGIS3的可能互作因子,进行酵母单杂和双荧光素酶实验,结果表明,AtGIS和AtGIS2与PaGIS3之间不存在直接互作。4.PaGIS3、PaZFP6和PaZFP8在烟草中超量表达,显著增加了烟草叶片腺毛的密度和长度,引起植株早花,并改变了烟草的叶型与株型。其中PaZFP8转基因株系的柱头与花药、PaZFP6转基因株系的花丝上部均出现了异位表皮毛。PaGIS3和PaZFP8的超量表达也引起了花器官的异常,转基因株系的柱头高于雄蕊,花药不开裂,无法正常结实,表现为不育。其中PaGIS3在烟草中超量表达还引起了花器官向着萼片方向的同源异形转变,转基因烟草花瓣萼片化,而雄蕊花瓣化。此外,PaGIS3和PaZFP6的超量表达还促进了叶绿素的积累,使得叶片更绿,叶绿素合成相关基因的表达显著上调。而PaZFP6的超量表达还促进了花青素的积累,转基因株系花药和花瓣明显变红。
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