肝细胞癌(以下简称肝癌)是最常见的恶性肿瘤之一,位居全球恶性肿瘤发病率第六位、死因的第三位。在我国为恶性肿瘤的第二位死因,也是肝硬化病人最主要的死亡原因。尽管近几十年来肝癌临床和基础研究取得了长足的进步,但总体而言,肝癌预后并无显著改善,总的5年生存率仍不足5%。手术目前仍是治疗肝细胞癌最有效的方法,但远期疗效欠满意,其中最主要的原因是肝癌极高的转移复发率:即使是根治性切除的患者,5年转移复发率仍高达60-70%,局部治疗则更高。因此,深入研究肝癌转移复发机制、找出有效预测肿瘤复发的指标、积极预防和及时治疗复发是提高肝癌患者总体疗效的关键所在。肝癌复发转移是多环节、多阶段、多基因参与的动态过程。传统的肿瘤研究多注重于肿瘤细胞自身,试图从癌细胞本身基因与表型改变来解释肿瘤的发生及进展。随着基因、分子生物学技术的进展,人们发现:作为与肿瘤密不可分的肿瘤局部微环境对肿瘤演进起着不容忽视的重要作用。微环境与肿瘤细胞之间存在复杂的交叉对话、相互利用的关系,这种相互作用的结果反映、改变甚至逆转了肿瘤生物学特性,对肿瘤表观遗传学、干细胞、免疫逃逸、转移潜能等等产生重要的影响。肿瘤微环境之所以日益受到重视,就是在传统研究的不足基础上,看到了癌与宿主互动的极其重要性。更有研究发现,肿瘤局部微环境免疫学因素是一个优于TNM分期的,迄今为止最准确的独立预后指标。因此,肿瘤学家和免疫学家们逐渐达成公识:癌症是一种免疫和微环境疾病。肝细胞癌治疗效果之所以不尽如人意,其中很重要的原因之一是我们对人体早期肝癌的生物学特性知之甚少。早期肝癌的研究对于控制肿瘤进展,延长患者生存具有重要的意义:①研究表明,早期相对良性的肿瘤向晚期恶性状态演变的过程中,免疫编辑起着重要的作用。免疫编辑分免疫清除、免疫对抗、免疫逃逸3个过程,在肿瘤的不同发展阶段,免疫编辑的方式也有所不同,早期肿瘤局部微环境中,以免疫清除为主要作用方式。免疫清除是指机体免疫系统识别肿瘤细胞,并且通过多种途径杀伤肿瘤组织的过程,在该阶段,如果机体能成功清除肿瘤组织,肿瘤免疫编辑至此结束,如果不能完全清除,则进入免疫对抗和免疫逃逸阶段,肿瘤亦发展为中晚期。因此,对于早期肝癌局部免疫微环境的研究能让我们了解并掌握免疫清除的机制,以便能最大限度地发挥免疫清除的功能,使其不进入免疫对抗甚至免疫逃逸的阶段,从而有效控制肿瘤的进展。②研究早期肝癌患者术后复发转移的预测符合肿瘤防治中“早”的原则,而中晚期肝癌患者本身具有极高的复发转移率,对其复发的预测反倒显的意义不大。③肿瘤的预后具有异质性,早期肿瘤预后并不一定好,因此通过对早期肝癌患者的研究,筛选出其中的高危人群进行恰当的干预,对提高整个肝癌患者人群的生存具有显著的价值。目前国际上有多种肝细胞癌的分期标准,但对早期肝癌的定义并没有一定的共识。传统“小肝癌”的定义具有早期肝癌的模糊影子,但不完全等同于早期肝癌的概念,原因有①对小肝癌瘤体大小的设定没有统一的公认的标准(2cm、3cm、5cm不等);②有些小肝癌早期就出现微小转移灶,这也是许多肝癌患者根治术后早期复发转移的原因。现在临床上最为常用的是BCLC分期对早期肝癌的定义,即单个肿瘤结节≤5cm,或结节≤3个,每个直径≤3cm,无血管侵犯及肝外转移,肝功能A或B级,生活状态WHO标准C级,在早期肝癌里,如单个结节直径≤2cm,肝功能A级则称为非常早期肝癌。这一定义是术前的判断标准,具有镜下癌栓(微血管侵犯)的患者也被纳入其中。而我们在第一部分的研究中发现,癌栓在各个临床病理特征中是导致术后复发和较差生存的最重要的因素,其危险度远大于肿瘤大小、包膜、分化、数目等。在我们的研究队列中,无镜下和/或肉眼癌栓患者的5年无瘤生存和总生存分别为59%和64%,显著好于上述定义的BCLC早期患者的52%和56%。我们认为:对于肝癌术后预测复发和生存的研究而言,无镜下和/或肉眼癌栓作为早期肝癌的定义具有良好的代表性和实用性。肝脏作为免疫特惠器官具有独特的免疫系统并参与机体局部及整体水平免疫调节,而肝癌微环境在肝癌发生发展和侵袭转移的演进中发挥了异常重要的作用。我所高强等人在先前工作中全面分析了27个免疫效应/过继免疫、免疫抑制和炎症相关的基因,找出了8个与肝癌转移复发显著相关的免疫效应/过继免疫基因(GNLY、GZMB、TRAV10、CD3Z、TBX21、IFNG、GATA3、IRF1),并在此基础上建立了“免疫微环境分子预测模型”,进一步证实了免疫微环境在肝癌转移复发中的作用。因此,探索肝癌微环境中影响肿瘤恶性表型、侵袭转移能力等特征的免疫细胞的特性,从细胞、分子,基因等水平综合评价构成肝癌微环境的各组分之间的相互关系,对于肝癌的诊断、分期分型、靶向性治疗、预防转移复发、提高疗效具有十分重要的意义。本研究首先从肝癌微环境中免疫活性细胞的层面和角度,利用组织微阵列和免疫组化技术,原位、在体和系统地探索了肝癌局部微环境中肿瘤浸润淋巴细胞不同类型(亚型)、数目、部位与功能状态在肝癌(尤其是无镜下和/或肉眼癌栓的早期肝癌)复发转移中的作用,发现肝癌微环境中免疫抑制细胞和免疫效应细胞之间的比例关系是肝癌转移复发和总生存的独立预测指标。提出了:肿瘤局部微环境中免疫抑制作用与免疫效应作用两者缺一不可,它们之间的力量对比关系决定了局部的免疫状态,并影响、甚至决定了肿瘤的进展程度和方向,两者相互制约,相互影响。局部免疫效应作用越强,越不利于肿瘤生长侵袭,反之,局部免疫抑制作用越强,则越有利于肿瘤侵袭转移。然后对我所高强博士提出的“免疫微环境分子预测模型”在各种不同肝癌患者群体(总体、无癌栓、BCLC分期A期)中的复发转移危险程度进行验证和评估。并评价各种肿瘤浸润淋巴细胞亚型在高低不同风险组间的差异,提出预测模型与癌内调节性T细胞联合能更好的预测不同发展阶段的肝癌患者复发与生存情况。实现了将分子与细胞两个不同层面的因素结合起来证实免疫微环境在肝癌预后方面的重要意义,也证实了肿瘤微环境中各组成成份之间具有一个多层次、多角度、多环节的相互关系。第一部分肿瘤浸润淋巴细胞与肝细胞癌复发转移关系的研究本研究旨在从细胞水平探索肝癌局部微环境中各种肿瘤浸润淋巴细胞亚型的数目、部位、功能状态在肝癌复发转移中的作用,找出能影响肝癌复发转移的预测指标。本研究中,我们随机选取了2002年1月—2006年12月之间在复旦大学附属中山医院行根治性手术切除的肝细胞癌患者298例。利用高通量的组织微阵列及免疫组化染色,研究癌内及癌旁微环境CD57+NK细胞、Foxp3+调节性T细胞、Granzyme B+活化的细胞毒性淋巴细胞、CD45RO+记忆T细胞、CD8+细胞毒T细胞的分布、数目与肝癌复发转移的关系。结果发现:(1)除FOXP3+Treg癌内细胞数大于癌周细胞数外,其余各免疫效应细胞的细胞数均表现为癌周远远大于癌内。(2)单因素生存分析示:癌内微环境中所有的细胞都与DFS、OS显著相关(P均＜0.05),其中除了IFOXP3+Treg与DFS、OS呈负相关外(P均＜0.001),其余各免疫效应细胞(ICD57+、ICD45RO+、IGrB+、ICD8+)与DFS、OS均呈正相关。在癌周微环境中,所有的细胞都与DFS显著相关,而与OS相关的仅PFOXP3+Treg和PCD8+TILs。(3)多因素生存分析发现:癌内微环境中:IFOXP3+Treg与患者的DFS、OS显著负相关(HR=2.312,P＜0.001/HR=2.267,P＜0.001)。而ICD8+和ICD45RO+TILs与患者的DFS、OS呈显著正相关(ICD8+:HR=0.499,P=0.005/HR=0.481,P=0.002;ICD45RO+:HR=0.436,P＜0.001/HR=0.634,P=0.038)。癌周微环境中与DFS密切相关的有PCD8+TILs和PCD45RO+TILs,与OS显著相关的有PCD8+TILs。在临床病理特征中,肿瘤分化、数目、癌栓与DFS呈显著负相关;而与OS显著负相关的有术前血清γGT、肝硬化、肿瘤分化、癌栓。(4)将IFOXP3+Treg与各免疫效应细胞联合分组分别经多因素分析,发现癌内微环境中Treg与各免疫效应细胞间的比例关系均可作为DFS及OS的独立预测指标(P均＜0.001)。(5)将IFOXP3+Treg联合各免疫效应细胞分组的各组经多因素生存分析证实,癌内微环境Treg少,同时免疫效应细胞多者DFS和OS均较好(Ⅰ组);而反之,癌内微环境Treg多,同时免疫效应细胞少者DFS和OS均较差(Ⅳ组),其预测能力远远优于目前临床上常用的大小、包膜、数目、分化等肿瘤进展的衡量标志,甚至优于公认的TNM分期和癌栓(Ⅰvs.Ⅳ组的HR均最大,P值最小)。(6)癌内微环境中各TILs与癌栓都具有显著相关性,癌栓阳性者,其局部浸润的IFOXP3+Treg更多,而癌栓阴性者,则局部浸润的ICD57+、ICD45RO+、IGrB+、ICD8+更多。与肿瘤分化密切相关的有IFOXP3+Treg和ICD45RO+(分化越差,IFOXP3+Treg越多;分化越好,ICD45RO+越多)。与肿瘤大小密切相关的有ICD45RO+和ICD8+TILs(肿瘤直径越大,ICD45RO+和ICD8+TILs局部浸润越少)。IGrB+TILs还与肿瘤的包膜及数目显著相关(肿瘤有包膜和/或单发者,局部浸润的IGrB+TILs更多)。癌周微环境中各TILs与肝癌的临床病理特征均无显著相关性。以上结果表明,作为构成免疫微环境的重要组成部分,肝癌局部的肿瘤浸润淋巴细胞是一个复杂的多细胞群体,它们之间及其与肿瘤细胞之间的相互作用,在肝癌复发转移中起了十分重要作用。在越靠近肿瘤的局部微环境中,以FOXP3+Treg为主导的免疫抑制优势状态越明显,并抑制了其他免疫效应细胞的浸润和功能。肝癌局部微环境中免疫抑制与免疫效应作用的的力量对比关系决定了局部的免疫状态,并影响、甚至决定了肿瘤的进展方向,局部免疫效应作用越强,越不利于肿瘤生长侵袭,反之,局部免疫抑制作用越强,则越有利于肿瘤侵袭转移。因此,通过综合评价肝癌微环境中肿瘤浸润淋巴细胞类型、数量、分布以及功能状态可以准确地把握肝癌患者局部免疫状态,也提示了更深入研究免疫微环境与肝癌的相互作用、探索肝癌侵袭转移和免疫逃逸机制的理论意义和临床指导价值。第二部分肿瘤浸润淋巴细胞与早期肝细胞癌复发转移关系的研究本研究旨在从细胞水平探索肝癌局部微环境中各种肿瘤浸润淋巴细胞在早期肝癌(无肉眼和/或镜下癌栓)中的分布情况,评价各细胞数目、部位、功能状态在早期肝癌复发转移中的作用,找出能影响早期肝癌复发转移的预测指标,筛选出早期肝癌患者术后转移复发的高危人群。本研究中,我们选取了第一部分患者队列中经病理证实无镜下和/或肉眼癌栓的患者167例。利用高通量的组织微阵列及免疫组化染色,研究癌内及癌旁微环境CD57+NK细胞、Foxp3+调节性T细胞、Granzyme B+活化的细胞毒性淋巴细胞、CD45RO+记忆T细胞、CD8+细胞毒T细胞的分布、数目与早期肝癌复发转移的关系。结果发现:(1)仅FOXP3+Treg癌内细胞数大于癌周细胞数,其余各免疫效应细胞的细胞数均表现为癌周远远大于癌内。(2)单因素生存分析示:癌内微环境中,IFOXP3+Treg与DFS、OS呈负相关(P=0.030/0.003),而ICD45RO+TILs与DFS、OS均呈正相关(P=0.010/0.012)。在癌周微环境中,PFOXP3+Treg仅与OS呈负相关(P=0.032),PGrB+与DFS、OS均呈正相关(P=0.005/0.039)。(3)多因素生存分析发现:ICD45RO+TILs与DFS、OS均呈显著正相关(P＜0.001,P=0.003);而IFOXP3+Treg及PFOXP3+Treg仅与OS呈显著负相关(P=0.034/0.033),与DFS却无显著相关性。在临床病理特征中,AFP与DFS呈显著负相关(P=0.002);肿瘤分化及γGT与OS呈显著负相关(P=0.038/0.002)。不论是对于DFS还是OS而言,较多的癌内微环境ICD45RO+TILs都具有良好的保护作用。(4)将癌内微环境中FOXP3+Treg与各免疫效应细胞联合分组分别经多因素分析,发现Treg与各免疫效应细胞间的比例关系均可作为OS的独立预测指标,但与第一部分结果不同的是,仅以Treg与CD45RO+TILs的比例关系能同时预测DFS和OS。(5)将IFOXP3+Treg联合ICD45RO+TILs分组的各组经多因素生存分析证实,分析发现,癌内微环境Treg少,同时CD45RO+TILs多者DFS和OS均较好(Ⅰ组);而反之,癌内微环境Treg多,同时CD45RO+TILs少者DFS和OS均较差(Ⅳ组),其预测能力也远优于其他临床病理特征,包括TNM分期(HR最大,P值最小)。(6)癌内微环境中:IFOXP3+Treg的细胞数目与肿瘤的数目及分化有显著相关性,肿瘤的数目多和/或分化差者,局部浸润的IFOXP3+Treg数目更多。IGrB+TILs与肿瘤包膜有密切相关,肿瘤有包膜者,局部浸润的IGrB+TILs数目更多。ICD45RO+TILs与肿瘤分化及TNM分期有显著相关性,ICD45RO+TILs局部浸润多者,肿瘤分化及分期更好。癌周微环境中:无一癌周TILs与肿瘤病理特征有显著相关性。以上结果表明,在早期肝癌的局部微环境中,以CD45RO+记忆T细胞作为主导细胞发挥的免疫效应作用占优势,而起着免疫抑制作用的Treg则处于弱势(多因素分析中,FOXP3+Treg与DFS无相关性)。这也验证了我们第一部分提出的肝癌局部微环境中免疫抑制与免疫效应作用的的力量对比关系决定了局部的免疫状态,并影响、甚至决定了肿瘤的进展程度和方向,局部免疫效应作用越强,越不利于肿瘤生长侵袭,反之,局部免疫抑制作用越强,则越有利于肿瘤侵袭转移。结合第一部分的结果,我们也可以设想:随着肿瘤的生长进展,肿瘤局部的免疫平衡被不断打破,至中晚期时,已逐渐形成了以Treg为代表的免疫抑制为主导的局部免疫状态。因此,通过综合评价肝癌微环境中肿瘤浸润淋巴细胞类型、数量、分布以及功能状态,准确地把握肝癌患者局部免疫状态,筛选出早期肝癌患者术后转移复发的高危人群,进行及早干预,对提高整个肝癌患者人群的生存率具有深远的意义。第三部分肿瘤浸润淋巴细胞与“免疫微环境分子预测模型”的关系本研究旨在通过联合分子和细胞两个不同层面,研究“免疫微环境分子预测模型”与局部微环境中肿瘤浸润淋巴细胞之间的关系,找出模型预测的转移复发的风险与患者实际转移复发之间存在差异的原因,并探讨该预测模型与免疫细胞联合进一步提高肝癌转移复发预测能力的可能。我所高强博士等人在筛选了27个与肝癌转移复发相关的免疫效应/过继免疫、免疫抑制和炎症相关代表基因的基础上,建立了以8个癌内免疫效应/过继免疫相关基因(GNLY、GZMB、TRAV10、CD3Z、TBX21、IFNG、GATA3、IRF1)为主的“免疫微环境预测模型”。RS8=(-4.554×IFNG value)+(-4.820×TBX21value)+(-4.472×GATA3 value)+(-6.554×GZMB value)+(-6.934×IRF1 value)+(-4.810×GNLY value)+(-4.077×CD3Z value)+(-3.758×TRAV10 value)。RS值越高,表明患者复发转移的风险越大。该模型反映了癌内微环境中免疫效应/过继免疫在肝癌复发转移过程中的作用,对肝癌复发转移具有较高的预测能力。本研究中,我们仍利用第一部分研究随机选取的298例肝癌患者。首先,检测这298例肝癌标本的8个模型应用的癌内免疫效应/过继免疫相关基因(GNLY、GZMB、TRAV10、CD3Z、TBX21、IFNG、GATA3、IRF1)的表达情况,并根据上述模型公式计算出每位患者的RS8分值,利用前期研究设定的cutoff值将298例患者分为复发转移高危组和低危组。首先对高低风险两组进行生存分析以验证模型的预测效率;然后分析低风险组患者中部分早期出现复发、高风险组患者中却有长期不复发现象的原因及其与局部肿瘤浸润淋巴细胞之间关系;最后将“免疫微环境分子预测模型”与局部TILs联合分析来预测肝癌的复发转移。结果发现:(1)K-M生存曲线分析:对于总体298例患者,RS8模型在无瘤生存和总生存两方面均可以将患者显著区分为高危和低危组(P均＜0.001)。对于167例无癌栓患者,RS8模型在无瘤生存方面可以将患者区分为高危和低危组(P=0.019),而在总生存上则无法显著区分高危和低危组(P=0.076)。对于156例BCLC分期A期的患者,RS8模型在无瘤生存和总生存两方面均可以将患者显著区分为高危和低危组(P=0.039,P=0.021))。(2)比较各TILs与RS8模型的关系发现:癌内微环境CD57+、GRB+、CD45RO+、CD8+TILs与RS8模型之间均呈显著相关性(P均＜0.001),相反的,FOXP3+Treg与RS8模型间则未见显著相关性,癌周微环境中各TILs与RS8模型间也均无显著相关性。(3)用细胞原始连续计数法、中位数法、最小P值法这三种不同的方式分组TILs,分别分析高/低风险组患者实际复发与否及其与TILs关系发现:癌内微环境FOXP3+Treg与RS8模型中高/低风险患者实际是否复发都有显著的相关性(详见表21)。(4)将RS8模型与IFOXP3+Treg联合行K-M生存曲线分析可见:对三个不同的肝癌患者组成群体(总体298例患者、167例无癌栓患者、156例BCLC分期A期患者)而言,它都能将DFS、OS显著区分为高危和低危组(P均＜0.001),其中,RS低风险同时IFOXP3+少者(Ⅰ组)在DFS和OS上均有良好的预后;相反的,RS高风险且IFOXP3+多者(Ⅳ组)DFS和OS均较差。(5)将RS8模型与IFOXP3+Treg联合进行多因素分析发现:RS8模型联合IFOXP3+Treg预测DFS、OS危险度的效率较单独RS8模型要更好(HR更高)。(6)联合RS8模型与IFOXP3+Treg进行AUC分析显示:RS8模型联合IFOXP3+Treg的ROC曲线下面积最大(AUC=0.699),显著优于RS8模型(AUC=0.635),也大于BCLC分期(AUC=0.657)、TNM分期(AUC=0.617)、癌栓(AUC=0.670)等目前临床上常用的肝癌预后预测指标。以上结果表明,“免疫微环境分子预测模型”能较好的预测肝癌的复发转移,但其仅从分子层面探索了代表癌内免疫效应/过继免疫对肝癌复发转移及预后的影响,忽略了局部微环境中免疫抑制因素所发挥的作用。“免疫微环境分子预测模型”联合FOXP3+Treg对肝癌患者预后的较高的预测效率证实了分子与细胞这两个不同的研究层面是互动的,也进一步说明了肿瘤局部微环境的免疫状态取决于免疫效应作用与免疫抑制作用的协调,两者相互制约,相互影响。因此,从细胞、分子,基因等水平综合评价构成肝癌微环境的各组分之间的相互关系,对于肝癌的诊断、分期分型、靶向性治疗、预防转移复发、提高疗效具有十分重要的意义。结论1)肝癌微环境调节性T细胞、记忆T细胞、细胞毒性T细胞与根治性切除术后复发转移密切相关。癌内微环境免疫抑制细胞(调节性T细胞)及其与各免疫效应细胞(NK细胞、记忆T细胞、活化的细胞毒性淋巴细胞、细胞毒性T细胞)的比例关系是肝癌术后复发转移和总生存的独立预测指标。从细胞水平表明了免疫微环境在肝癌发生发展中的重要作用。2)癌内微环境中记忆T细胞、调节性T细胞与早期(无镜下和/或肉眼癌栓)肝癌患者根治性切除术后复发转移和生存密切相关。记忆T细胞及其与调节性T细胞的比例关系是早期肝癌术后复发转移和总生存的独立预测指标。3)我所高强等人建立的“免疫微环境分子预测模型:对肝癌转移复发有较好的预测效率,具有较高的稳定性和一定的通用性。4)“免疫微环境分子预测模型”联合调节性T细胞能更好的预测肝癌患者根治性切除术后复发转移和总生存,证实了分子与细胞这两个不同的研究层面是互动的,也进一步说明了肿瘤局部微环境的免疫状态取决于免疫效应作用与免疫抑制作用的协调,两者,相互制约,相互影响,缺一不可。创新点1)首次发现和报道了肝癌微环境中调节性T细胞和记忆T细胞的比例关系是早期肝癌术后复发转移和总生存的独立预测指标,并显示了筛选早期肝癌患者术后复发高危人群的效率。2)通过对“免疫微环境分子预测模型”的验证及其与局部肿瘤浸润淋巴细胞关系的研究,将分子与细胞两个不同的层面结合起来评估肝癌微环境在肝癌转移复发和预后中所起的重要作用。潜在应用价值1)肝癌微环境免疫活性细胞的类型(亚型)、数目、分布和功能状态是术后复发转移的新的独立预测指标,可用于临床筛选高危复发患者和指导术后治疗。2)肝癌微环境中调节性T细胞和记忆T细胞的比例关系是早期肝癌术后复发转移和总生存的独立预测指标,可用于筛选出临床上早期肝癌患者术后复发的高危人群,并提供了预防复发的靶点。3)分析癌内微环境免疫活性细胞的状态,联合“免疫微环境分子预测模型”可以提高单独使用模型的预测效率,用于肝癌患者复发转移和总生存的前瞻性预测并指导个体化治疗的实施。