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COVID-19（Coronavirus disease-19）致病病原体“2019-n CoV”于2020年2月被国际病毒分类委员会冠状病毒科研究小组重新命名为SARS-CoV-2（Severe acute respiratory syndrome coronavirus clade 2）。先前已鉴定出感染人类的六种冠状病毒,包括HCoV-NL63、HCoV-229E、HCoV-OC43、HCoV-HKU1,重症急性呼吸综合征冠状病毒（Severe acute respiratory syndrome coronavirus,SARS-CoV）和中东呼吸综合症冠状病毒（Middle east respiratory syndrome coronavirus,MERS-CoV）。SARS-CoV-2与后两者一样同属于冠状病毒科下的β冠状病毒属,它们是有包膜的正义单链RNA病毒,蝙蝠是其天然宿主。本课题研究的SARS-CoV-2（Gen Bank:NC＿045512.2）来源于已经测序确定的武汉新型冠状病毒基因,即武汉/IVDC-HB-01/2019（GISAID登录号:EPI＿ISL＿402119）,在系统发育树中比SARS-CoV更接近蝙蝠SARS相关CoV（SARSr-CoV）—Ra TG13。由病毒感染引发的宿主天然免疫反应是识别和消除病原体感染的第一防线,随后免疫环境中细胞因子的产生启动了宿主细胞两个保守的抗病毒程序。一方面促炎细胞因子和趋化因子IL-6、TNF-α,GM-CSF等连同粒-单核、淋系亚群募集到病灶部位产生炎症反应;另一方面,I型干扰素（Interferon type I,IFN-I）的表达通过结合细胞干扰素受体进而激活下游一系列干扰素诱导基因（Interferon stimulated genes,ISGs）的表达,促进细胞的抗病毒效应,直接抑制已感染细胞的病毒复制,抑或导致病毒感染细胞的凋亡从而发挥干扰素抑制病毒复制的效应。而在此过程中病毒也可能侵入宿主的干扰素系统,规避干扰素效应以实现自我复制,此外,干扰素的过度产生或效应也可能导致机体免疫紊乱和组织损伤。对于SARS-CoV-2而言,其与宿主干扰素抗病毒系统之间的潜在相互作用现在倍受关注。已有研究报道IFN-I可有效地限制包括SARS-CoV-2在内的多种冠状病毒的感染,如IFN-I诱导跨膜蛋白家族（Interferon-induced transmembrane protein,IFITM）的表达能够抑制SARS-CoV-2的入胞,这对SARS-CoV也同样适用。在本课题中,我们瞄准I型干扰素下游途径,为了确定SARS-CoV-2编码的基因产物是否会影响IFN-I的效应,我们使用人支气管上皮细胞来源的BEAS-2B细胞系和人非小细胞肺癌来源的A549细胞系在体外对SARS-CoV-2的所有结构蛋白和非结构蛋白进行筛选,通过q RT-PCR检测抑制病毒复制经典的类泛素化蛋白ISG15和介导感染后细胞凋亡的经典分子TRAIL二者m RNA的表达,借此观察IFN-I下游效应。结果发现,25种SARS-CoV-2编码蛋白中S蛋白可以最为显著地增强ISG15和TRAIL的活化,且这种活化效应不依赖于IFN-α的刺激。S蛋白是病毒附着、融合和进入宿主细胞内最重要的结构蛋白,它也是开发抗体、抑制剂和制备疫苗的优选靶标。S蛋白介导病毒进入宿主细胞首先通过S1亚基中的受体结合域（Receptor binding domain,RBD）与受体结合,然后S2亚基构象发生改变,被宿主表达的肽酶切割而激活,与受体膜融合介导病毒进入细胞。SARS-CoV,SARS-CoV-2和MERS-CoV的RBD识别不同的受体,前两者的RBD结构域存在大量同源区段,将血管紧张素转换酶2（ACE2 angiotensin converting enzyme 2,ACE2）作为其受体,而MERS-CoV将二肽基肽酶4（Dipeptidyl peptidase 4,DPP4）作为其识别受体。我们对BEAS-2B和A549细胞进行体外转染实验,在无IFN-α刺激的情况下外源转染S蛋白表达载体后对细胞进行转录组分析,对差异表达基因和通路进行富集。与对照组相比,BEAS-2B细胞过表达S蛋白后能够诱导一系列ISGs的升高。此前已有报道发现ACE2是一种新的ISG,人原代呼吸道上皮细胞在IFN-I的刺激下,ACE2的表达会发生上调,从而可能给SARS-CoV-2进入宿主细胞提供了更多的受体,而这些升高的ISGs中恰恰包括SARS-CoV-2受体ACE2。因此我们把目光锁定在了ACE2上。ACE2蛋白存在不同的分子异构体,且均表达于支气管上皮细胞,但在A549细胞中微弱表达甚至不表达,因此我们选择BEAS-2B细胞进行后续试验。在BEAS-2B细胞中高表达S蛋白不同亚单位S1、S2、RBD后发现,只有S蛋白的全长能够显著上调拥有19个外显子的ACE2长转录本的表达。缺少N端结构域的delta ACE2的表达并无显著上调,delta ACE2因为无法形成与S蛋白RBD区结合的空间结构域,不能作为S蛋白结合和SARS-CoV-2进入细胞的受体。因此,我们认为长转录本ACE2是S蛋白促进表达的主要转录本,并且ACE2的表达上调有可能介导了SARS-CoV-2感染的进一步加剧。为研究S蛋白促进ACE2表达的机制,我们将BEAS-2B细胞高表达S蛋白之后的转录组差异基因进行了KEGG信号通路富集分析,结果发现I型干扰素下游JAK-STAT通路在S蛋白高表达组和对照组之间存在显著差异,因此为探讨S蛋白促进ACE2表达的具体机制,我们把焦点放在JAK-STAT信号通路中。通过Western blot分析我们发现S蛋白能够增强STAT1和STAT2的磷酸化活化,且免疫共沉淀（co-Immunoprecipitation,co-IP）实验表明S蛋白能够分别和JAK1,STAT1和STAT2发生结合,并且介导了JAK1与其下游STAT1和STAT2的结合增加,进而可能促进了STAT1和STAT2的磷酸化,导致ACE2表达增加。此外,我们构建了JAK1、STAT1、STAT2蛋白的不同功能区段,通过co-IP实验证明了S蛋白能够偶联JAK1和STAT1、STAT2分子,且S蛋白中S1结构域能够与JAK1的假激酶结构域相互作用,而S2结构域能够与STAT1、STAT2的N端结构域相互作用,促进了JAK1与下游STAT1和STAT2的结合增加,进而促进了I型干扰素效应途径,激活ACE2的表达。综上,本研究中我们发现SARS-CoV-2结构蛋白S通过增强干扰素效应信号通路的活化,促进SARS-CoV-2受体ACE2的表达,进而可能介导了SARS-CoV-2进一步感染支气管上皮细胞,为SARS-CoV-2与机体天然免疫交互作用提供了一个新的视角,为后续针对SARS-CoV-2蛋白组分设靶的防治策略提供了潜在依据与思考方向。