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【目的】随着社会生产方式和交通运输方式的快速转变,脊髓损伤(spinal cord injury,SCI)的发病率呈逐年增高的态势,而运动保护不当所造成的SCI也逐渐引起人们的重视。严重的SCI可能会导致自主功能和运动感觉功能的异常,如瘫痪、大小便困难、痛觉过敏、以及难以缓解的神经痛等,严重者甚至可能导致死亡。而目前尚无有效治疗SCI并恢复患者运动功能的有效方法。SCI根据发生过程的不同时间段以及迥异的机制可分为原发性损伤和继发性损伤。前者是由直接或间接作用于脊髓的初始外力引起。后者是基于前者,通过一系列生理和生化机制,尤其是炎症反应,导致组织自身的破坏性病变,进一步加深并扩大损伤程度。脊髓损伤后的炎症反应复杂,大量研究表明,SCI引起的炎症反应具有神经损伤和神经保护的双重作用,SCI急性期星形胶质细胞活化有助于密封和隔离坏死细胞,重建血脑屏障完整性。而SCI后期由于过度的胶质瘢痕形成,阻碍神经再生,进而抑制运动功能恢复。因此,有必要在SCI修复中使用其正负两相效应,适时抑制炎症反应以最小化其损伤,同时选择性地发挥其修复潜力。二甲双胍是一种口服降糖药,被广泛用于二型糖尿病的治疗。大量研究表明,二甲双胍可有效抑制炎症反应。前期试验研究证明,在小鼠脊髓损伤急性期使用大剂量二甲双胍抑制炎症反应可导致小鼠死亡率增高,同时抑制运动功能恢复。本课题旨在探究应用二甲双胍治疗脊髓损伤、改善运动功能的最佳时期,使其能够平衡损伤后炎症反应的两相作用,为脊髓损伤的治疗提供新的临床策略。【方法】本实验采用16周龄体重30克左右C57BL/6小鼠,建立脊髓胸11(T11)节段脊髓损伤小鼠模型,随机分为3组:对照(Control)组、急性期治疗(0dpi)组和亚急性期治疗(3dpi)组,每组10只。其中0dpi组采用100mg/kg二甲双胍于脊髓损伤后立即进行腹腔注射并连续注射7天,3dpi组采用100mg/kg二甲双胍于脊髓损伤后3天进行注射并连续注射7天,而Control组则采用同等剂量的PBS溶液于脊髓损伤后进行腹腔注射并持续7天。于脊髓损伤后1天,4天,7天,14天,21天,35天,42天对各组小鼠进行BMS评分,观察其运动功能恢复情况;于脊髓损伤后42天进行PAS运动功能测试,监测其后肢站立及行走功能;脊髓损伤后42天,获取脊髓组织进行冰冻切片,获取各组小鼠脊髓组织,通过神经元核心抗原(neuronal nuclear antigen,NeuN)免疫荧光染色在共聚焦激光扫描显微镜(Laser scanning confocal microscope)下观察神经元的保存及再生情况;通过神经胶质纤维酸性蛋白(Glial fibrillary acidic protein,GFAP)免疫荧光染色观察损伤后脊髓损伤区域周围星形胶质细胞增生及胶质瘢痕形成情况;通过抗离子钙结合衔接蛋白(anti-ionized calcium binding adaptor protein,Iba-1)免疫荧光染色观察小胶质细胞和巨噬细胞的激活情况,进而反映二甲双胍对损伤后炎症反应的抑制作用;通过Ly-6G/Ly-6C(Gr-1)免疫荧光染色观察损伤后损伤区域中心中性粒细胞的聚集情况,反映损伤中心的炎症改变。【结果】根据各组实验小鼠术后及治疗后的死亡率绘制存活率曲线,术后42天3dpi治疗组死亡率为20%,0dpi治疗组死亡率为30%,而Control组死亡率达到50%。而术后一周的死亡率统计显示,一周内3dpi治疗组和0dpi治疗组死亡率为20%,而Control组死亡率达到40%。BMS运动功能评分显示,从术后14天起,3dpi治疗组和0dpi治疗组评分明显高于对照组,且3dpi治疗组小鼠运动功能恢复明显优于0dpi治疗组(P<0.01)。至术后42天,3dpi治疗组小鼠运动功能评分恢复至6-8分,明显优于0dpi治疗组和Control组(P<0.05)。PAS运动功能测试显示,术后42天,3dpi治疗组小鼠的后肢站立功能和行走功能明显优于0dpi治疗组和Control组(P<0.05)。对各组小鼠脊髓组织切片损伤区域进行NeuN和GFAP免疫荧光染色,在激光扫描共聚焦显微镜下观察显示,与0dpi治疗组和Control组相比,3dpi治疗组脊髓组织切片损伤区域保留了更多的神经元,而GFAP阳性细胞明显减少(P<0.05),且3dpi治疗组损伤空洞面积明显小于0dpi治疗组和Control组。对各组脊髓组织切片损伤区域进行Iba-1染色和Ly-6G/Ly-6C(Gr-1)免疫荧光染色,激光扫描共聚焦显微镜观察显示,3dpi治疗组损伤区域小胶质细胞和巨噬细胞数量相对于0dpi治疗组和对照组明显减少(P<0.01)。3dpi治疗组和0dpi治疗组脊髓损伤区域中性粒细胞数量明显少于Control组,而3dpi治疗组和0dpi治疗组之间的中性粒细胞数量无明显差异。【结论】1.脊髓损伤后立即采用大剂量二甲双胍冲击治疗可导致死亡率增高,运动功能恢复缓慢;2.脊髓损伤亚急性期采用适量二甲双胍治疗,可抑制神经元凋亡,减轻炎症反应,减少中性粒细胞聚集,抑制损伤部位小胶质细胞和星形胶质细胞过度增生,从而抑制胶质瘢痕扩大,促进修复脊髓损伤;3.脊髓损伤亚急性期采用适量二甲双胍治疗,可促进运动功能恢复。