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猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2,PCV2)是引起猪圆环病毒相关疾病(Porcine circovirus associated disease,PCVAD)的重要病原,给全球养猪业造成重大经济损失。但PCV2单独感染的致病力不强,共感染或继发感染或环境应激,可以触发PCVAD。受限于自身基因组大小和编码能力,PCV2复制在很大程度上依赖于宿主细胞,因此易引起内质网应激、氧化应激和自噬等细胞应激反应。本实验室研究表明,PCV2能通过与相关宿主因子的相互作用,调控宿主细胞的应激反应从而促进自身复制。高迁移率族蛋白1(High mobility group box 1protein,HMGB1)是高度保守的非组蛋白染色体结合蛋白,在细胞中的功能取决于其在细胞内的位置,在核内主要起DNA分子伴侣作用。研究表明,氧化应激或一些病毒感染可以引起HMGB1在细胞中重新分布,并在病毒感染过程中发挥重要作用。那么,PCV2感染引起的内质网应激是否诱导氧化应激?通过何种机制诱导?由此产生的氧化应激是否影响HMGB1在细胞内的分布?HMGB1是否影响PCV2复制?通过何种机制影响病毒复制?本论文针对这些科学问题展开了系统研究,目的是解明PCV2利用宿主细胞应激反应,促进其自身复制的分子机制。主要研究内容和结果如下:1.核内HMGB1负调控PCV2复制通过免疫印迹、免疫荧光等技术分析HMGB1蛋白在PCV2感染的PK-15细胞或3D4/31细胞(猪肺泡巨噬细胞)中的表达和分布情况,发现PCV2感染可以诱导HMGB1向核外转移至细胞质,但不影响HMGB1的转录和表达。利用过表达或基因沉默技术调节HMGB1在细胞内的水平,并分析其对PCV2复制的影响。结果显示,过表达HMGB1能够抑制PCV2复制,细胞内病毒DNA拷贝数、m RNA水平以及病毒衣壳蛋白(Cap)表达水平均下降;而下调HMGB1表达,可以显著促进PCV2的复制,表明HMGB1负调控PCV2复制。为探究是否是核内HMGB1调控PCV2复制,我们将PCV2感染细胞进行HMGB1出核抑制剂处理,发现丙酮酸乙酯可以有效抑制PCV2诱导的HMGB1出核,并抑制PCV2在细胞中的复制;而用甘草酸抑制胞外HMGB1活性(直接与其结合)并不影响病毒复制。以上结果表明,细胞核内HMGB1可抑制病毒复制,而PCV2感染可以促使HMGB1向核外转移。那么,核内HMGB1如何影响PCV2复制?2.核内HMGB1通过与病毒基因组DNA复制起始区茎环结构结合影响PCV2复制为探明HMGB1是否与病毒基因组DNA互作?互作过程涉及哪个区域?我们制备了PCV2基因组全长和包含或不包含复制起始区(Ori)的不同DNA片段(orf1、orf2、Ori-orf1和Ori-orf2),并构建了表达HMGB1全长或不同结构域截短蛋白(A box、AB box和B box CT)的载体,通过凝胶阻滞或DNA结合蛋白免疫共沉淀分析HMGB1蛋白-病毒DNA互作,结合病毒复制水平检测,发现只有携带B box的区域与全长HMGB1一样可以抑制病毒在PK-15细胞中的复制,且只有携带复制起始区茎环结构的病毒DNA片段与HMGB1互作才能阻滞蛋白-DNA复合物在凝胶中的迁移。表明HMGB1中的B box结构域是影响PCV2复制的关键区域,核内HMGB1通过与病毒DNA的复制起始区茎环结构结合抑制病毒复制。3.PCV2通过提高胞内活性氧水平促进HMGB1出核和自身复制应用流式细胞术检测PCV2感染PK-15细胞中的活性氧(Reactive oxygen species,ROS)水平变化,抗氧化剂乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine,NAC)和过氧化氢(H2O2)处理PCV2感染细胞,结合分析HMGB1在细胞核内外的分布。我们发现PCV2感染可以显著提高细胞内ROS水平和核内HMGB1向核外转移;用NAC处理PCV2感染细胞,可抑制HMGB1向核外转移,并抑制病毒复制;用H2O2处理PCV2感染细胞,则在促进HMGB1出核的同时,增强PCV2复制。以上结果表明,PCV2感染可增加细胞中ROS水平,引起氧化应激并促进HMGB1向核外转移,降低了核内HMGB1对病毒DNA复制的抑制,有利于PCV2复制。4.PCV2感染诱导内质网应激和氧化应激促进HMGB1向核外转移本实验室前期研究表明,PCV2感染可激活PK-15或3D4/31细胞内质网应激的PERK-e IF2α-ATF4-CHOP通路;已知ERO1α(内质网氧化还原酶1α)受CHOP调控,参与内质网新生蛋白的氧化折叠,并将电子传递给氧分子,最后形成H2O2。我们通过RNA干扰下调PERK蛋白表达、GSK2606414抑制PERK磷酸化或用EN460抑制ERO1α活性,结合细胞内ROS、HMGB1核内外分布以及病毒复制水平的检测,发现PERK或ERO1α抑制均能下调PCV2感染细胞中的ROS水平,抑制HMGB1向核外转移,且PCV2复制受到显著抑制。表明PCV2诱导的内质网应激可以伴随氧化应激,且内质网应激引起的ROS水平增加足以促进HMGB1向核外转移,进而降低核内HMGB1对病毒DNA复制的抑制。5.PCV2诱导内质网氧化还原稳态失衡和HMGB1出核的分子基础在PK-15细胞中过表达PCV2的ORF1(Rep)、ORF2(Cap)、ORF3、ORF4和ORF5蛋白,发现只有Rep和Cap促进ERO1α表达、ROS产生以及HMGB1向核外转移。通过对Rep和Cap中半胱氨酸残基分析,构建了Cap C108S以及RepC107S和Rep C305S的突变蛋白,与野生型蛋白相比,半胱氨酸置换均显著降低它们对PERK和ERO1α的激活作用,下调ROS水平,抑制HMGB1出核。为进一步探究这三个半胱氨酸残基在PCV2感染过程中的作用,通过反向遗传技术构建携带Rep和Cap中半胱氨酸残基单突变和三突变的重组病毒PCV2Rep1(C107S)、PCV2Rep2(C305S)、PCV2Cap1(C108S)和PCV2Rep1/2-Cap1。结果表明,只有三突变的重组病毒(PCV2Rep1/2-Cap1)对PERK和ERO1α的激活作用减弱,并显著降低胞内ROS水平、减少HMGB1向核外转移,病毒复制及增殖水平也显著下降。提示内质网中半胱氨酸介导的蛋白氧化折叠和ROS产生量在单一蛋白水平和全病毒水平之间存在差别,可能与单一蛋白过表达和全病毒水平相关蛋白的表达量存在一定差异有关,也可能是全病毒水平半胱氨酸残基的协同作用所致。综上所述,本研究首次报道了宿主蛋白HMGB1与PCV2基因组DNA之间的相互作用及其对PCV2复制的影响:核内HMGB1通过与病毒基因组DNA的复制起始区茎环结构结合,起到抑制病毒复制的作用,是一种抗PCV2复制的宿主因子。阐明了PCV2通过诱导细胞应激逃避宿主抗病毒反应的新机制:PCV2通过激活PERK-ERO1α系统,在发生内质网应激的同时伴随氧化应激,产生的ROS足以促使核内HMGB1向胞质转移,降低核内HMGB1对病毒基因组DNA的“劫持”,进而有利于PCV2复制。研究结果为猪场通过抗氧化辅助手段防治PCVAD提供借鉴,为深入探索PCV2在宿主体内的相关应激激活机制奠定重要基础。