【摘 要】
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猪圆环病毒二型(Porcine Circovirus 2,PCV2)是引起猪圆环病毒相关疾病(Porcine Circovirus Associated Diseases,PCVAD)的主要病原体,自上世纪九十年代发现以来,PCV2在全球
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猪圆环病毒二型(Porcine Circovirus 2,PCV2)是引起猪圆环病毒相关疾病(Porcine Circovirus Associated Diseases,PCVAD)的主要病原体,自上世纪九十年代发现以来,PCV2在全球养殖业中迅速蔓延并呈不断扩张趋势,2000年郎洪武等在我国首次报道了该病毒的存在。PCV2作为一种猪场常见病原体,主要引发断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS),也参与导致母猪繁殖障碍、猪呼吸道疾病综合征(PRDC)以及猪皮炎肾病综合征(PDNS)等多种相关的慢性疾病。PCV2感染机体后常常集中在淋巴母细胞和单核细胞等免疫相关细胞内,肺泡巨噬细胞是其主要的靶细胞,在病毒感染早期,肺泡巨噬细胞的抗原递呈和加工会受到轻微损伤。病毒配体与受体的结合是病毒侵染靶细胞的关键步骤,受体识别是病毒黏附到靶细胞表面的第一步,在病毒的致病机理和传染扩散方面起着至关重要的作用。因此寻找PCV2在靶细胞上的受体蛋白对于揭示病毒入侵细胞及致病机制必不可少。虽然已发现一些PCV2细胞广谱性受体,但是病毒与靶细胞相结合后如何作用,病毒粒子通过何种途径跨膜进入靶细胞,以及病毒在靶细胞内如何复制增殖,目前还不能清晰解释病毒的这些生命过程,这就更需要我们对PCV2与靶细胞之间的相互作用做更深入的研究。本课题使用E.coli原核表达系统表达PCV2衣壳蛋白Capsid,利用Ni柱亲和层析法对蛋白进行纯化,并将Cap蛋白在缓冲液中透析,体外组装成病毒样颗粒(VLPs)。VLPs作为一种伪病毒,仅由病毒的结构蛋白构成,几乎不含有任何遗传物质,具有同天然病毒相似的免疫原性。实验中利用间接免疫荧光检测VLPs对PK15、3D4/2和Hela等不同细胞系的侵染情况,IFA结果显示VLPs同野生型病毒一样对细胞具有侵染能力。将PCV2 VLPs侵染猪肺泡巨噬细胞3D4/2细胞系,利用免疫共沉淀-质谱技术分析感染后的蛋白质组学,成功鉴定到46中差异蛋白,这些差异蛋白大部分位于细胞质和细胞器中,具有结合活性和催化活性。将这些差异蛋白搜索数据库,我们发现一个基因序列与nucleolin(human)高度一致的特殊蛋白质(蛋白号为I3LRH2),该蛋白在各物种中基因序列高度保守,具有多种生物学功能。为了后续研究方便,暂将猪属蛋白I3LRH2也称为核仁素(nucleolin,NCL)。为了探究在细胞中过表达NCL是否能增加PCV2的侵染及复制能力,实验中构建了带有FLAG标签的重组质粒pcDNA-TOPO-FNCL、pcDNA-TOPO-NCLF,并将其转染到Hela细胞中,实时荧光定量PCR结果显示在细胞中过表达NCL能增加PCV2的病毒载量。为了探究NCL下调后对PCV2感染的影响,研究中设计了3对siRNA干扰细胞中NCL的表达,利用荧光定量PCR检测发现,将细胞中的NCL表达下调后会导致PCV2 mRNA水平降低。这些结果暗示着细胞中的核仁素对PCV2侵染及复制方面具有调控作用,对于揭示病毒入侵细胞及其在细胞中的复制机制具有一定的指导意义。
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