【摘 要】
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滞育是昆虫为躲避寒冷等极端不良自然环境而进化出的一种个体发育停滞的生存策略。家蚕滞育受到家蚕滞育激素（Bombyx mori diapause hormone,BmDH）的调控。BmDH是由24个氨基酸组成的神经肽,通过特异性结合并激活家蚕滞育激素受体（Bombyxmori Diapause hormone receptor,BmDHR）而转导其信号,并最终诱导家蚕胚胎滞育。本论文对BmDHR的表
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滞育是昆虫为躲避寒冷等极端不良自然环境而进化出的一种个体发育停滞的生存策略。家蚕滞育受到家蚕滞育激素（Bombyx mori diapause hormone,BmDH）的调控。BmDH是由24个氨基酸组成的神经肽,通过特异性结合并激活家蚕滞育激素受体（Bombyxmori Diapause hormone receptor,BmDHR）而转导其信号,并最终诱导家蚕胚胎滞育。本论文对BmDHR的表达与特性、BmDH/BmDHR介导的MAPK/ERK信号通路、BmDH与BmDHR特异性结合的结构基础、以及家蚕CAPA受体信号通路和BmDH/BmDHR信号通路的交叉激活进行了研究,取得的主要结果如下:1、通过一系列细胞功能实验,研究BmDHR介导的具体信号转导通路。结果表明,BmDHR主要定位在细胞膜上,当被BmDH激活后,能与Gαq蛋白亚基偶联,导致细胞内Ca2+水平升高和cAMP响应元件驱动的荧光素酶反应活性显著增加,但不引起cAMP积累。2、BmDHR被BmDH激活后引起胞内ERK磷酸化并呈BmDH作用浓度和作用时间依赖性,Gαq抑制剂、PLC抑制剂、PKC抑制剂、Ca2+螯合剂、Gβγ抑制剂、PI3K抑制剂和MEK抑制剂对BmDHR介导的ERK磷酸化表现出显著的抑制作用。RTKs反式激活途径不影响BmDHR介导的ERK磷酸化。3、通过Cy5.5标记的BmDH竞争性结合试验、一系列关于BmDHR被激活后介导的下游信号转导通路的细胞功能实验以及蛋白质结构模拟,研究BmDH与BmDHR的特异性结合的结构基础。结果表明,BmDH的C端最后6位氨基酸（DH6）是其激活BmDHR所需的最少氨基酸残基,其中Arg23和Leu24对于BmDH与BmDHR的结合和激活是必不可少的,Trp19和Phe20也有助于BmDH介导 BmDHR 的功能活性;BmDHR 的 Glu89、Phe172、Phe194 和 Tyr299 位点在BmDHR与BmDH发生结合以及介导下游信号转导通路中起到重要作用;BmDH的C端6个氨基酸残基结合到由BmDHR的N端、ECL1、ECL2、ECL3、TM2、TM3 和 TM5-TM7 包围的口 袋中,BmDHR 上 TM3 的 Cys 106 位点和 ECL2的Cys183位点之间的二硫键锚定ECL2,用于与BmDH的结合。4、在 Bm-CAPA-PVK-1 或-PVK-2 刺激下,Bm-CAPA-PVK-R2 显著增加细胞内cAMP响应元件控制的萤光素酶活性和Gαq蛋白依赖的Ca2+水平,并引起胞内ERK磷酸化,其效应均呈现Bm-CAPA-PVK-1或-PVK-2作用浓度和作用时间依赖性;ERK磷酸化可以被Gq抑制剂、PLC抑制剂、PKC抑制剂、PLD抑制剂、Ca2+螯合剂、Gβγ抑制剂、PI3K抑制剂和Src抑制剂显著抑制,并且受到酪氨酸蛋白激酶（Receptor Tyrosine Kinase,RTK）的转激活途径调控。β-arrestin1/2不调控Bm-CAPA-PVK-R2介导的ERK磷酸化,但参与ERK磷酸化依赖的受体内吞。此外发现Bm-CAPA-PK可以激活BmDHR介导的下游信号转导通路,BmDH也可以激活Bm-CAPA-PVK-R1Δ341（BNGR-A25S）介导的下游信号转导通路。本研究阐明了 BmDHR被激活后介导的下游信号转导通路以及BmDH/BmDHR结合的结构基础,并且发现家蚕CAPA/CAPA受体信号转导通路与BmDH/BmDHR信号转导通路间存在交叉激活反应。研究结果为全面解明家蚕胚胎滞育的分子机理做出了贡献,也为后续进一步研究其他不同昆虫滞育机制研究提供了新思路。
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