家蚕新突变体褐色类鹑斑q-ι~b的遗传分析及基因定位

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家蚕遗传资源十分丰富,是一种重要的模式生物群体,而家蚕皮肤表面积累的色素则形成了诸多的类型,为科研提供了新的材料和研究方向。我们在培育过程中,在0223金黄品种中发现了一种类似于鹑斑的褐色类鹑斑突变体(q-lb),其幼蚕期体色呈褐色,因此对该突变体进行研究分析对探究色素调节途径具有重要的理论和现实意义。本研究主要包含以下个方面:一、突变体q-lb的经典遗传学分析将褐色类鹑斑(q-lb)与正常型素斑进行杂交,F1代在正反交中表型均是正常型,F2代出现正常型和褐色类鹑斑两种表型,其分离比为3:1,正反交F1代回交正常型个体,回交后代均表现为正常型;正反交F1代回交褐色类鹑斑,回交后代中出现正常型和褐色类鹑斑两种表型,其分离比为1:1,证明了褐色类鹑斑由1个隐性基因q-lb控制,并且非伴性遗传。用第2、3、4、5、6、7、9、12、13、14、16、18、19、21、26连锁群中的形态标记检测,通过配制F1和F2群体,无论正反交,F1均未分离,且无褐色类鹑斑出现。F2出现分离,q除了第7连锁群外,其余的连锁群都出现了9:3:3:1分离比。而第7连锁群用的是鹑斑(q)作为形态标记,由于突变体斑纹与鹑斑极其类似,肉眼无法分辨,出现非鹑斑(素斑112头)与鹑斑(鹑斑或类鹑斑共86头)的分离比为9:7。此现象类似于非等位基因间的互作关系,褐色类鹑斑与鹑斑有“互补关系”(complementary genes)。在此可以确定尽管褐色类鹑斑与鹑斑表型相似,但为非等位基因。上述说明突变基因不在这些连锁群上。二、q-lb基因的连锁分析及精细定位在其他连锁群上,用P1、F1和P2来筛选具有多态性的SSR标记;BC1F群体用来确定q-lb基因所在的连锁群;275个BC1M个体用来对q-lb基因进行定位分析。结果显示,q-lb基因位于第8连锁群上,根据电泳观察筛选出20个与突变基因连锁的多态性SSR标记,最终将q-lb基因定位在S2828-30与S2828-37两个多态性标记之间,相距230kb,用Mapmaker绘制出q-lb基因的分子标记连锁图。所得到的q-lb基因的连锁图的遗传距离为17.7cM。三、候选基因的分析在定位分析的基础上,通过分析两个标记之间的18基因在家蚕表皮和脂肪体中半定量的结果,我们发现其中16个基因表达无差异,而其余两个基因中BGIBMGA005383因cDNA太短,未能设计出半定量引物;BGIBMGA005418则是开放阅读框(ORF)未能成功克隆,其功能都与生长发育相关。为了确定是否是突变基因,则需要进一步研究证实该基因及其突变位点。四、类鹑斑突变体q-lb表皮组织差异蛋白质谱分析我们通过双向电泳技术对正常型0223金黄及突变体q-lb的表皮组织进行蛋白质组学分析,结果发现BGIBMGA007789基因编码的Bmrunt蛋白出现两个差异点,其中一个在正常型中表达量高,而在突变体q-lb中表达量低,另一个在正常型中表达量低,而在突变体中表达量高;BGIBMGA008906基因编码的Bmcryptochrome2蛋白在正常型中表达量低甚至不表达,而在突变体q-lb中表达量高。随即对BGIBMGA007789和BGIBMGA008906这两个基因的外显子分别进行克隆,比对发现引起蛋白差异的这两个基因未发生突变。综上所述,正常型与突变体q-lb表皮之间出现的蛋白差异并非由于编码该蛋白的基因发生突变引起的。这两个差异蛋白都是与生长发育相关的蛋白,而表皮斑纹的突变是在蚕体发育过程中发生的,推测与这两个差异蛋白有直接或间接的关系。
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