【摘 要】
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非洲猪瘟（African swine fever,ASF）是由非洲猪瘟病毒（African Swine fever virus,ASFV）引起的一种急性、烈性、出血性传染病,该病主要感染家猪和各种野猪,ASF是世界动物卫生组织法定报告的动物疫病,该病也是我国重点防范的一类动物疫病。由于ASFV基因组庞大,编码的蛋白质种类多,已经发现在受感染的巨噬细胞中编码超过150种蛋白质,所以其免疫逃逸机制非常
【基金项目】
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山东省重点研发计划（重大科技创新工程）项目（项目编号:2020CXGC010801-01-01）
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非洲猪瘟（African swine fever,ASF）是由非洲猪瘟病毒（African Swine fever virus,ASFV）引起的一种急性、烈性、出血性传染病,该病主要感染家猪和各种野猪,ASF是世界动物卫生组织法定报告的动物疫病,该病也是我国重点防范的一类动物疫病。由于ASFV基因组庞大,编码的蛋白质种类多,已经发现在受感染的巨噬细胞中编码超过150种蛋白质,所以其免疫逃逸机制非常复杂,目前仍没有发现有效的防控机制,市场上也没有有效的商品化疫苗可用。ASFV是一种双链DNA病毒。其基因组在170～193 kbp范围内,编码多种结构蛋白和100多种非结构蛋白。ASFV感染后会引起炎症因子风暴,紊乱机体的免疫反应,加速死亡。p72蛋白是病毒重要的结构蛋白和免疫原性蛋白,对病毒侵入和复制至关重要,是目前疫苗研究的首先蛋白。但p72蛋白调控机体免疫反应的机制还未清楚,p72含有1923aa,相对较大,其具体发挥免疫功能的区域不清楚。p72在ASFV感染有大的炎症因子风暴中的作用也未知。为了探讨ASFV p72蛋白诱导免疫反应的关键区域及其对细胞因子产生的影响,本研究构建了GFP-p72和p CMV-myc-p72重组质粒转染多种细胞,通过荧光定量PCR检测分析了IFN-α、IFN-β、IFN-γ、IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10和TNF-α的基因水平,结果表明,p72蛋白在多种细胞内都能促进IFN-α和IFN-β的产生,其中以IFN-β的促进效果最为显著。通过双荧光素酶检测系统分析IFN-β启动子的荧光活性进行进一步验证,结果显示,ASFV p72能够诱导IFN-β的产生并增强IFN-β启动子的活性,对启动子增强的效果呈剂量依赖性。为了探究ASFV p72发挥诱导IFN-β产生作用的具体序列,将p72基因分为四段并构建到p CMV-myc载体中,通过RT-PCR和双荧光素酶报告基因检测分析了IFN-β的基因水平变化和启动子活性变化,发现p72的559-1155aa发挥主要诱导IFN-β产生的作用,p72的559-1320aa发挥主要激活IFN-β启动子活性的作用。已有证明ASFV通过c GAS-STING信号通路调节Ⅰ型干扰素产生,为了研究p72蛋白参与何种信号通路,将p CMV-myc-p72转染进HEK293T细胞后Western blot检测IRF3和TBK1的磷酸化,发现,p72的559-1320aa显著促进IRF3的磷酸化。为寻找与p72相互作用且参与诱导IFN-β表达的细胞蛋白,通过Co-IP、质谱分析和Western blot等方法检测出细胞内CAD、TIMM50、DNAJA1和LGALS3BP与p72蛋白存在相互作用。为进一步验证p72与多种蛋白的作用情况,利用激光共聚焦检测p72与三种内源性蛋白的细胞内分布,发现,p72与TIMM50存在明显的细胞内共定位。通过慢病毒感染发现,p72能促进内源性CAD、TIMM50、DNAJA1和LGALS3BP的蛋白水平,TIMM50和LGALS3BP能够增强p72诱导的IFN-β启动子的激活。综上所述,本研究结果证明ASFV p72可以增强IFN-β启动子的激活并诱导IFN-β的产生,主要作用区域为p72的559-1155aa。p72的559-1320aa能促进IRF3的磷酸化。免疫共沉淀和激光共聚焦发现p72与TIMM50存在作用关系。TIMM50和LGALS3BP能够增强IFN-β启动子的激活。该研究为揭示ASFV参与宿主天然免疫反应提供新的理论依据。
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