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目的:稀土元素(rare earth elements,REEs)是元素周期表中的镧系元素(原子序列57到71)以及钪和钇,可分为铈组稀土(轻稀土)以及钇组稀土(重稀土),这些元素具有特殊的理化性质,并以共生形式存在于自然界。目前,稀土作为我国的重要优势资源,被广泛的应用于包括工业、农业、水产养殖、畜牧业以及医药等备受关注的产业,因此,REEs已与我们的生产生活发生了紧密的联系。由于地化因素和生物富集作用,REEs可通过饮水、食物链、医药和日常生活接触等方式经由消化道、呼吸道和皮肤进入机体并在其中蓄积,并诱发多种有害效应。其中,REEs的神经毒性引起了人们的高度重视。1996~2005年间的环境流行病学调查发现,稀土矿区儿童与对照区儿童比较,其推理能力、注意力、学习记忆能力和智商均数都明显低下,其智商下降程度与家中堆放稀土和住所与矿区距离近有较高相关性,是一类可明显影响智力发育和认知功能的环境因子。镧(Lanthanum,La)是一种应用广泛的轻稀土元素,生物活性和脑蓄积性均非常显著,常作REEs神经毒作用研究或神经毒理机制研究的代表性元素。研究表明,La可通过损伤血脑屏障紧密连接进入脑组织,诱发神经细胞氧化应激,扰乱细胞内Ca2+、酶及神经递质等物质的分布、平衡和活化状态,破坏神经细胞及其细胞器的结构、形态和功能,进而损害学习记忆功能,但具体机制尚不完全清楚,有待进一步阐明。自噬是细胞将胞质中的有害蛋白质、受损细胞器通过溶酶体途径降解从而重复利用的过程,是细胞抵御各种应激来维持自身稳定的重要机制。目前认为,自噬有三种方式,分别为微自噬、巨自噬及分子伴侣介导自噬。其中,巨自噬的研究最多且最为深入。在巨自噬中,细胞首先通过多种机制形成双层膜结构包裹细胞质内的待降解蛋白和细胞器,逐步形成自噬体,继而与溶酶体融合,最终形成自噬溶酶体并将内容物降解。自噬具有两重性:适度的自噬使细胞维持稳态从而存活,不足或过度的自噬则可能引起细胞损伤甚至死亡。因自噬异常增强所致的细胞死亡又被称为Ⅱ型程序性细胞死亡。氧化应激(Oxidative stress,OS)是机体内过度失衡的氧化反应簇与抗氧化反应簇,导致氧化过程处于优势地位的现象。大量生成活性氧(reactive oxygen species,ROS)是氧化应激的重要特征之一。研究证明,c-jun氨基末端激酶(c-Jun NH2-terminal kinase,JNK)相关信号通路激活常由ROS介导,并促进其下游的自噬相关基因(autophagy associated gene,ATG)m RNA表达增加,进而导致自噬的持续增强,并引起细胞受损甚至死亡。神经元作为CNS的影响学习记忆功能的主要功能执行者,是其关键结构和基础功能单位。本课题以原代培养的大鼠皮质神经元为研究对象,建立体外试验模型。在使用不同浓度的氯化镧(La Cl3)处理后,观察大鼠神经元结构变化、ROS-JNK信号通路激活与否及其对ATGs水平的影响程度,为从自噬异常的角度来阐释镧的神经毒作用机制提供新的实验和理论依据。研究方法:应用SPF级wistar大鼠(licence number:SYXK(辽)2013-0001),36只,体重260±10g,由中国医科大学实验动物中心提供,饲养在恒温恒湿环境(22±1℃;45~55%);自由饮水摄食。饲养1 w适应环境后,每周依次合笼9只,雌:雄=2:1,发现阴栓或阴道分泌物视为受孕成功,约21 d仔鼠出生。取出生后24 h内的仔鼠,断头取皮质,原代培养神经元,7d成熟后给予La Cl3染毒,用于后续测定各项指标。1、原代神经元纯度鉴定:免疫荧光法(neuron-specific enolase,NSE神经元特异性烯醇化酶Ⅰ抗)。2、神经元的存活率测定:MTT比色法、乳酸脱氢酶(LDH)释放量测定。3、神经元中ROS含量测定:流式细胞术。4、神经元中JNK1/2/3、c-jun、Fox O1、Fox O3a、Atg7、Atg12、Becn1、Lc3b m RNA水平测定:Real-Time PCR法。5、神经元中JNK1/2/3、p-JNK、c-Jun、p-c-Jun、Fox O1、p-Fox O1、Fox O3a、p-Fox O3a蛋白水平测定:Western blot法。6、神经元内自噬体观察:透射电镜法。结果:1、La Cl3可诱发原代培养大鼠皮质神经元氧化应激,使ROS水平显著升高。2、La Cl3可使神经元内p-JNK、p-c-jun(ser63)、p-c-jun(ser73)、p-Fox O1(ser256)、p-Fox O1(Thr24)、p-Fox O3a(ser253)的蛋白磷酸化水平显著上调。3、La Cl3可促进自噬相关基因Atg7、Atg12、Becn1、Lc3b的m RNA水平,并导致神经元内的自噬异常增强。4、上述结果提示La Cl3可通过ROS介导JNK-c-Jun和JNK-Fox Os信号通路活化,进而上调下游自噬相关基因的m RNA水平,促进自噬的发生。结论:1、La Cl3可诱发原代培养大鼠皮质神经元氧化应激,致使ROS水平显著升高。2、La Cl3可通过ROS介导JNK/c-Jun和JNK/Fox Os信号通路活化,进而促进自噬相关基因Atg7、Atg12、Becn1、Lc3b的m RNA水平升高,并导致神经元内的自噬异常增强。