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上世纪80年代以来,随着世界多国对虾养殖业的蓬勃发展,对虾疾病也引起人们越来越多的关注。对虾疾病主要分为传染性疫病与非传染性疫病,前者病原的种类主要包括病毒、真菌、细菌和寄生虫,其中以病毒性传染性疫病的危害最为严重。目前已报道的对虾病毒性疫病有20余种,对养殖产业造成较大影响的病毒性疫病主要包括:对虾白斑综合征(White spot syndrome disease,WSD)、对虾杆状病毒病(Disease of baculovirus penaei,BP)、传染性皮下与造血器官坏死病(Infectious infectious hypodermal and hematopoietic necrosis,IHHN)、黄头病(Yellow head disease,YHD)、桃拉综合征病毒病(Taura syndrome disease,TSD)、传染性肌肉坏死病(Infectious myonecrosis,IMN)、罗氏沼虾白尾病(Macrobrachium rosenbergii whitish muscle disease,WTD)、斑节对虾杆状病毒病(Monodon baculovirus disease,MBV)和病毒性偷死病(Viral covert mortality disease,VCMD)等。上述病毒性疫病的传播流行使对虾养殖业遭受了巨大的经济损失,人们对这些疫病的病原、致病机理以及感染所引发的虾类免疫响应等开展了大量研究,但对这些病原的源起、在近海环境中的传播、分布和遗传演进,以及对近海野生种群的影响等研究却几无涉及。这些研究的缺失,使人们无法清晰的把握养殖虾类疫病病原的来源和去向,不能有效的评估养殖活动对虾类自然种群和近海生态环境的潜在影响,有碍学界在探究疫病暴发流行起因研究上取得突破性进展,不利于未来人们应对新疫病的预警和预防工作。基于此,本研究以VCMD这种新发的对虾疫病为主要研究对象,系统分析了2013~2015年间我国沿海省市陆地池塘养殖虾类中VCMD病原——偷死野田村病毒(Covert mortality nodavirus,CMNV)的流行情况;对渤海、黄海与东海开放海域中CMNV的宿主种类、感染特征、传播范围与流行情况开展了全面调查;并初步对比了陆地池塘养殖虾类与开放海域野生虾类中CMNV的流行趋势与遗传演进。另外还选取了WSD与IHHN这两种虾类重大疫病为研究对象,调查了其病原在渤海海域野生虾类中的存在和流行情况。首先,本研究采用逆转录环介导等温扩增(RT-LAMP)、反转录套式PCR(RT-nPCR)、病毒基因系统进化、组织病理、RNA原位杂交(ISH)和透射电子显微镜(TEM)等方法分析了CMNV在沿海地区陆地池塘养殖虾类中的流行和分布。RT-LAMP结果显示,沿海10个省市池塘养殖的多种甲壳类动物包括凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)、中国对虾(Fenneropenaeus chinensis)、日本囊对虾(Penaeus japonicus)、罗氏沼虾(Macrobrachium rosenbergii)与斑节对虾(Penaeus monodon)样品中均有CMNV阳性检出。2013年、2014年和2015年采集的样本中CMNV阳性检出率分别为45.93%(130/283)、27.91%(84/301)和20.85%(54/259)。组织病理分析结果显示,患病虾类出现肌肉溶解样坏死、肝胰腺小管萎缩等CMNV感染的典型病理症状。ISH结果进一步证实日本囊对虾与斑节对虾可以被CMNV感染。经RT-LAMP检测为阳性的样本,在TEM下可观察到靶组织存在大量CMNV样的病毒颗粒。该调查结果揭示,CMNV在我国养殖甲壳类中流行率非常高,其流行范围涵盖我国虾类养殖的主要地区,CMNV的传播和危害风险值得高度关注。为了评估CMNV在开放海域中存在和传播的可能性,本研究采用RT-LAMP、RT-nPCR、组织病理学、ISH与TEM等方法对从黄东海采集的冷温性优势种——脊腹褐虾(Crangon affinis)与暖温性优势种——戴氏赤虾(Metapenaeopsis dalei)样品进行了分析。RT-LAMP检测结果显示,采集自40个站点的112份脊腹褐虾样本中CMNV的阳性检出率为26.8%(30/112),采样点的CMNV阳性检出率为52.5%(21/40)。采集自27个站点的64份戴氏赤虾样本中CMNV的阳性检出率为35.94%(23/64),采样点的CMNV阳性检出率为51.85%(14/27)。对RT-LAMP检测呈现CMNV阳性的样品进行RT-nPCR、目标基因测序和多序列比对分析,结果表明来自脊腹褐虾与戴氏赤虾CMNV分离株的RdRp基因靶序列与来自陆地池塘养殖虾类CMNV分离株的RdRp基因靶序列具有99%的同源性。组织病理学分析显示,被CMNV感染的脊腹褐虾成虾的肌肉、腹部神经、中肠上皮、无节幼体以及戴氏赤虾的肌肉组织中均出现了明显的病理学变化。利用CMNV的RNA探针进行原位杂交分析,结果显示脊腹褐虾成虾肌肉、腹部神经、中肠上皮与无节幼体的肌肉中,以及戴氏赤虾的肌肉组织中均出现了明显的CMNV阳性杂交信号。TEM分析进一步证实ISH诊断呈现CMNV阳性的脊腹褐虾与戴氏赤虾组织细胞的细胞质中存在大量病毒包涵体和CMNV样颗粒。黄东海野生脊腹褐虾与戴氏赤虾在自然感染条件下感染CMNV,以及CMNV在黄东海海区高流行率的结果表明CMNV已扩散到近海生态环境中,并威胁着黄海和东海海域的甲壳类动物优势种。为了调查不同年度CMNV在开放海域中的流行情况,查明近海野生虾类中CMNV分离株与陆地池塘养殖虾类中CMNV分离株的亲缘关系,本研究2016年~2017年在渤海、黄海与东海开展了连续调查和样品采集工作,并利用RT-LAMP、RT-nPCR、组织病理、ISH与TEM等方法对所采集到的野生虾类样品进行了系统分析。RT-LAMP检测结果显示,采集自不同海区的27种野生虾类中,有18种虾类检出CMNV阳性;渤海海区样品中CMNV阳性检出率由2016年的29.04%(61/210)上升至2017年的30.93%(30/97),黄东海海区样品中CMNV的阳性检出率由2016年的9.80%(31/317)上升至2017年的29.10%(30/134)。对RT-LAMP检测呈现CMNV阳性的样品进行RT-nPCR、目标基因测序和多序列比对,结果表明来自开放海域野生虾类中的CMNV分离株与来自陆地池塘养殖虾类中的CMNV分离株之间存在一定程度的变异;系统进化树分析结果显示,黄渤海脊腹褐虾中的CMNV分离株与来自山东、江苏池塘养殖对虾中的CMNV分离株亲缘关系最近,与来自广西池塘养殖对虾中的CMNV分离株亲缘关系较远,与来自海南池塘养殖对虾中的CMNV分离株亲缘关系最远。利用CMNV的RNA探针对经RT-LAMP检测确定为阳性的样本进行ISH分析,杂交结果显示在东海红虾(Plesionika izumiae)、葛氏长臂虾(Palaemon gravieri)与脊腹褐虾坏死的肝胰腺小管中,葛氏长臂虾腹部神经组织中,以及戴氏赤虾坏死的肌肉中均出现了明显的阳性杂交信号。对呈现ISH检测阳性的样品进行透射电镜分析发现,在脊腹褐虾、戴氏赤虾、葛氏长臂虾、中华管鞭虾(Solenocera crassicornis)、日本囊对虾和哈氏仿对虾(Parapenaeopsis hardwickii)样品组织中存在大量的病毒包涵体和CMNV样颗粒。上述结果提示CMNV在野生海域野生虾类中大范围流行和高感染率带来的生态风险不容忽视。本研究利用RT-LAMP方法对2015年采自于渤海的野生虾类样品进行了白斑综合征病毒(White spot syndrome virus,WSSV)与传染性皮下及造血组织坏死病毒(Infectious hypodermal and hematopoietic necrosis virus,IHHNV)的流行情况分析。结果显示从39个站点采集的包括葛氏长臂虾、脊腹褐虾、脊尾白虾(Exopalaemon carinicauda)、日本鼓虾(Alpheus japonicus)、鲜明鼓虾(Alpheus distinguendus)、鹰爪虾(Trachypenaeus curvirostris)、疣背宽额虾(Latreutes planirostris)、中国毛虾(Acetes chinensis)和细鳌虾(Leptochela gracilis)9种野生虾类在内的272份样品中,WSSV的阳性检出率为47.79%(130/272),阳性站点率为97.44%(38/39),并且9种野生虾类中均有WSSV的检出。IHHNV的阳性检出率为5.88%(26/272),阳性站点率为43.59%(17/39),共在葛氏长臂虾、鹰爪虾、疣背宽额虾、中国毛虾4种野生虾类中检出。2013~2015年间沿海省市陆域池塘养殖虾类VCMD流行病学调查结果表明,CMNV在我国养殖甲壳类中流行率很高,其流行范围也非常广,涵盖从辽宁、河北、山东到广东、海南等我国沿海虾类养殖的主要地区。上述渤海、黄海和东海海区2016~2017年间的调查和研究证实,CMNV除了能够感染养殖池塘的甲壳类生物外还可以大范围感染开放海区的多种野生虾类,并且期间黄东海海区野生虾类中CMNV的流行率出现明显的升高趋势;结合本实验室最近查明的2016~2017年间陆域池塘养殖虾类中CMNV原始株系流行率下降、变异株流行率上升的现象,加之陆域来源CMNV遗传上呈现地理空间上的隔离特征、海区来源CMNV遗传上也表现一定程度的地理空间隔离,而近海野生虾类来源CMNV与其临近省份池塘养殖虾类来源CMNV表现出进化上的保守性;可以推测养殖池塘与近海之间的物质交换过程中存在着CMNV的交流和传播。渤海海区野生虾类中存在WSSV和IHHNV的高流行率的结果,提示其他重要养殖虾类病毒也广泛存在于近海生态系统中。本研究结果为证实虾病疫病病原跨“养殖池塘—近海海区”传播提供了详细和可靠的数据支持,该结果提示人们在未来应关注海水养殖疫病病原在近海生态系统中的传播扩散,及其对自然生态环境带来的潜在生物安全风险。