研究背景:急性心肌梗死再灌注治疗后发生心功能不全最主要的病理生理基础是缺血再灌注损伤(Ischemia/reperfusion,I/R)过程中造成了心肌细胞的凋亡和坏死。心脏干细胞(Cardiac stem cells,CSCs)作为一种理想的种子干细胞可显著修复梗死心肌、改善心肌重构和心功能。目前的研究认为,CSC移植治疗缺血性心肌病心功能的改善主要获益于细胞的旁分泌机制,而外泌体(Exosomes)是干细胞旁分泌效应中发挥主要作用的因子。与CSC相比,作为非细胞成分的CSC源Exosomes性能稳定,不易受移植后缺血微环境的影响,可避免干细胞移植时畸胎瘤的形成、免疫反应、细胞增殖分化有限等问题,同时还提供了生长因子等细胞保护因子,能够抗凋亡、抗纤维化,促进血管生成,增强心肌分化,修复受损组织。已有研究显示,缺氧预处理(Hypoxic preconditioning,HPC)能提高干细胞修复能力,同时也增强了干细胞源Exosomes心肌保护作用。既往有关心肌I/R发病机制的研究大多是集中在氧自由基、钙超载、炎症反应、线粒体损伤、细胞凋亡、内皮细胞活化和损伤以及自噬等方面,其中自噬被认为在心肌I/R中发挥着非常重要的作用。研究显示,自噬是将受损的、变性、衰老的长寿命蛋白及细胞器等底物运输到溶酶体内进行酶解消化,将底物还原为其组成成分并供细胞再利用的过程。在心脏组织中,自噬与凋亡对心肌细胞正常功能的维持至关重要。动物实验和细胞实验均证实,在I/R过程中,缺氧阶段,自噬水平适度升高可减轻缺氧所引起的损伤作用,当缺血的心肌组织恢复营养和氧气的供应后,活性氧物质(Reactive oxygen spieces,ROS)大量聚积,可见自噬显著上调,随着自噬水平的过度增高,通常伴随有心肌细胞自噬性死亡和心肌细胞凋亡的加剧。目前,关于HPC CSCs源Exosomes通过自噬调控缺氧复氧(HR)所诱导的心肌细胞凋亡的研究未见报道。本研究拟利用在HR诱导H9c2心肌细胞凋亡的基础上,观察HPC CSC源Exosomes对H9c2凋亡及自噬的影响,探讨Exosomes与损伤组织微环境之间的相互调节机制并为干细胞的非细胞治疗提供新的治疗靶向与策略。第一部分大鼠CSCs的培养及Exosomes的提取鉴定目的:培养实验所需的c-kit+CSCs,从常氧(Nor)及HPC的c-kit+CSCs培养上清液中提取并鉴定Exosomes,并对其进行鉴定。方法:(1)采用胶原酶消化法结合免疫磁珠分选法(MACS)培养实验所需的c-kit+CSCs并进行多方面鉴定:流式细胞术(FCM)检查MACS分选前后CSCs表面标记抗原(c-kit、CD34和CD45);细胞免疫荧光鉴定CSCs表面c-kit分子的表达;实时无标记细胞分析技术(RTCA)记录c-kit+CSCs生长曲线;CCK-8检测不同缺氧预处理(HPC)时间对c-kit+CSCs细胞活性的影响;q RT-PCR技术检测HPC对CSCs干性的影响。(2)采用超速离心法(UC)分别提取出Nor组c-kit+CSCs培养上清液中的Exosomes(Nor-Exo)及HPC组c-kit+CSCs培养上清液中的Exosomes(HPC-Exo)。Western Blot检测Exosomes表面4次跨膜蛋白CD9、CD63及Alix的表达;透射电镜(TEM)观察Exosomes形态;纳米颗粒追踪分析(NTA)分析Nor-Exo和HPC-Exo粒径大小、分布范围及浓度高低。结果:(1)原代细胞培养第10天左右,细胞密度达约80%-90%。随后采用MACS分选c-kit+CSCs,培养5天左右可见大量呈长三角形及长梭形的CSCs贴壁生长。经FCM鉴定,MACS后c-kit的阳性率可高达88.83%±3.45(P<0.05),同时免疫荧光观察到c-kit呈阳性表达。RTCA记录MACS后c-kit+CSCs的生长曲线,接种后约6h,c-kit+CSCs开始贴壁生长,接种后6h至22h为细胞潜伏生长期,培养1天后,细胞快速增殖进入对数生长期,约3天后,细胞指数(CI)曲线趋于平缓达到平台期不再增加。对c-kit+CSCs分别缺氧0、6、12、24h,经CCK-8检测细胞活力变化,结果显示,缺氧12h后c-kit+CSCs细胞活性显著上调(P<0.05)。q RT-PCR检测常氧及缺氧12h后c-kit+CSCs心肌谱系标记物m RNA表达无显著差异(P>0.05)。(2)采用超速离心法(UC)分别提取出Nor组c-kit+CSCs培养上清液中的Exosomes(Nor-Exo)及HPC组c-kit+CSCs培养上清液中的Exosomes(HPC-Exo),经Western Blot检测,Exosome表面CD9、CD63及Alix呈阳性表达;TEM观察见大小不一,呈圆形或椭圆形盘状或茶托盘状有脂质膜包裹的双层膜囊泡状结构;NTA结果发现,Nor-Exo组Exosome平均粒径大小为79.5nm,HPC-Exo组Exosomes的平均粒径大小为86.5nm,两者均在30-100nm之间,但HPC-Exo组Exosomes的浓度显著上调(P<0.05)。结论:(1)利用酶消化法结合MACS可有效培养出纯度较高的c-kit+CSCs;(2)c-kit+CSCs缺氧12h对CSCs的干性无影响。(3)UC可成功提取出c-kit+CSCs源Exosomes,符合Exosomes形态及特征;(4)HPC可促进c-kit+CSCs分泌Exosomes。第二部分CSCs源Exosome抑制HR诱导H9c2细胞凋亡的功能研究目的:观察经Nor-Exo及HPC-Exo对HR诱导H9c2细胞凋亡的影响。方法:(1)建立HR诱导H9c2的凋亡模型:采用FCM检测不同HR时间节点H9c2凋亡水平,选取诱导H9c2凋亡最佳的HR时间作为后续实验的处理条件;(2)将Di I标记的Exosomes与H9c2共培养不同时间,采用免疫荧光动态监测H9c2摄取Exosomes入胞,选择合适的共培养时间作为后续Exosomes与H9c2共培养的处理条件;(3)FCM检测不同浓度的Nor-Exo(0μg/ml、100μg/ml、200μg/ml、400μg/ml及800μg/ml)与H9c2共培养12h后对H24h R6h诱导H9c2凋亡的影响;(4)Annexin V-FITC/PI双染法检测400μg/ml Nor-Exo及HPC-Exo对HR诱导H9c2凋亡早期细胞膜内侧磷脂酰丝氨酸(PS)外翻的影响;ROS荧光探针DCFH-DA及Western Blot观察400μg/ml的Nor-Exo及HPC-Exo对HR诱导H9c2凋亡中期活性氧物质(ROS)及凋亡相关蛋白(Actived-Caspase-3、Bcl-2及Bax)活化的影响;Tunel染色观察400μg/ml的Nor-Exo及HPC-Exo对HR诱导H9c2凋亡晚期细胞DNA片段化的影响。结果:(1)H24h R6h组H9c2早期凋亡率及总体凋亡率(早凋+晚凋)显著上调(P<0.05),且死亡率与各组无显著差异(P>0.05),选取H24h R6h作为理想的HR诱导H9c2凋亡的处理条件;(2)共培养12h后H9c2摄取Exosomes达到最大化(P<0.05),选取Exosomes与H9c2共培养12h作为后续实验处理条件;(3)与0μg/ml、100μg/ml及200μg/ml组相比,400μg/ml组H9c2凋亡率显著下调(P<0.05),与800μg/ml组相比,细胞凋亡率无显著差异(P>0.05),选择400μg/ml Exosomes作为干预HR诱导H9c2凋亡的最佳处理浓度;(4)在HR诱导H9c2凋亡的基础上,与Nor-Exo组相比,HPC-Exo组在凋亡早期显著抑制了细胞PS的外翻(P<0.05);在凋亡中期显著抑制细胞内ROS的释放(P<0.05),下调Actived-Caspase-3及Bax蛋白表达水平(P<0.05,P<0.05),上调Bcl-2蛋白表达水平(P>0.05);在凋亡晚期显著抑制细胞DNA的片段化(P<0.05)。结论:(1)H24h R6h为HR诱导H9c2凋亡的最佳处理时间;(2)共培养12h后,H9c2可完全摄取c-kit+CSCs源Exosomes;(3)c-kit+CSCs源Exosomes在一定浓度范围内可呈浓度依赖性抑制HR诱导的H9c2凋亡;(4)HPC可增强c-kit+CSCs源Exosomes抑制HR诱导的H9c2早、中、晚期细胞凋亡。第三部分自噬及AMPK/m TOR信号通路介导的HPC CSCs源Exosomes抑制HR诱导H9c2凋亡的机制研究目的:在HR诱导H9c2凋亡的基础上,探讨自噬和AMPK/m TOR信号通路对HPC-Exo的抗凋亡效应影响。方法:(1)检测(1)Nor组、(2)HR组、(3)Nor-Exo组及(4)HPC-Exo组各组H9c2的自噬水平:Western Blot检测各组H9c2细胞自噬相关蛋白LC3-II、LC3-I及P62的表达水平变化;激光共聚焦显微镜观察转染双荧光标记的Ad-m RFP-GFP-LC3后各组H9c2胞内自噬体(AV1)及自噬溶酶体(AV2)数量的改变以评价自噬及自噬流的强弱;采用透射电镜(TEM)观察各组H9c2心肌细胞内自噬泡(AV)形态及数量的变化。(2)在HR诱导H9c2凋亡的基础上,加入雷帕霉素(Rapa)诱导及3甲基腺嘌呤(3-MA)抑制细胞自噬后观察HPC-Exo对H9c2细胞凋亡的影响。分组:(1)Nor组、(2)HR组、(3)HPC-Exo组、(4)HPC-Exo+Rapa组、(5)HPC-Exo+3-MA组。Western Blot检测各组细胞的自噬相关蛋白变化。Annexin V-FITC/PI双染、DCFH-DA及Western Blot及Tunel法检测各组细胞凋亡早期PS外翻、凋亡中期ROS及凋亡相关蛋白活化及凋亡晚期DNA片段化的影响。(3)在HR诱导H9c2凋亡的基础上,通过Western Blot观察HPC-Exo对AMPK/m TOR信号通路相关蛋白激活的影响。(4)加入Metformin(Met)特异性激活及Dorsomorphin(Dor)抑制AMPK的磷酸化后观察HPC-Exo对H9c2自噬和凋亡的影响。分组:(1)Nor组、(2)HR组、(3)HPC-Exo组、(4)HPC-Exo+Met组、(5)HPC-Exo+Dor组。Western Blot检测各组细胞的自噬相关蛋白的变化。Annexin V-FITC/PI双染,DCFH-DA、Western Blot及Tunel法检测各组细胞凋亡早期PS外翻,凋亡中期ROS释放、凋亡相关蛋白活化及凋亡晚期DNA片段化的影响。结果:(1)Western Blot结果显示与Nor组比较,HR组LC-3II/I表达水平显著上调(P<0.05),而P62蛋白表达水平显著下调(P<0.05),与HR组比较,Nor-Exo组LC-3II/I表达水平显著下调(P<0.05),而P62蛋白表达水平显著上调(P<0.05),与Nor-Exo组比较,HPC-Exo组自噬被进一步显著抑制(P<0.05);激光共聚焦结果表明,与Nor组比较,HR组AV1及AV2数量显著增多(P<0.05),与HR组比较,Nor-Exo组AV1及AV2数量显著下降(P<0.05),但与Nor-Exo组比较,HPC-Exo组AV1数量下调更为显著(P<0.05)但AV2数量无显著差异(P>0.05);TEM结果显示,HR组视野下可见显著增多的呈单层膜或双层膜结构包裹有胞浆内成分的AV(P<0.05),与HR组比较,Exo组H9c2胞内可见AV数量明显降低(P<0.05),但与Nor-Exo组比较,HPC-Exo组AV数量进一步显著下降(P<0.05)。这表明,在HR诱导H9c2凋亡的基础上,H9c2细胞自噬及自噬流显著增强,Nor-Exo可显著抑制HR诱导H9c2增强的自噬,同时,HPC可进一步显著增强c-kit+CSCs源Exosomes抑制H9c2增高的自噬及自噬流效应。(2)在HR诱导H9c2凋亡的基础上,加入雷帕霉素(Rapa)诱导及3甲基腺嘌呤(3-MA)抑制细胞自噬后观察HPC-Exo对H9c2细胞凋亡的影响。与HPC-Exo组比较,HPC-Exo+Rapa组LC3-II/I显著上调(P<0.05),P62表达显著下调(P<0.05),HPC-Exo+3-MA组LC3-II/I及P62的表达无显著差异(P>0.05);与HPC-Exo组比较,HPC-Exo+Rapa组凋亡早期PS外翻率显著上调(P<0.05),ROS释放比例显著增多(P<0.05),Actived-Caspase-3及Bax蛋白相对表达量显著上调(P<0.05)而Bcl-2表达显著下调(P<0.05),Tunel+细胞比例显著增多(P<0.05);而HPC-Exo+3-MA组PS外翻率显著下调(P<0.05),ROS释放比例显著下降(P<0.05),Actived-Caspase-3及Bax表达显著下调(P<0.05)而Bcl-2表达显著上调(P<0.05),但Tunel+细胞比例无显著差异(P>0.05)。以上结果表明,在HR诱导H9c2凋亡的基础上,加入Rapa增强自噬能够显著抑制HPC-Exo抑制HR诱导H9c2凋亡的效应,而进一步加入3-MA抑制自噬后增强了HPC-Exo抑制HR诱导H9c2的凋亡。(3)在HR诱导H9c2凋亡的基础上,通过Western Blot观察HPC-Exo对AMPK/m TOR信号通路相关蛋白激活的影响。结果显示,与Nor组比较,HR组P-AKT显著下调(P<0.05),P-AMPK显著上调(P<0.05),P-m TOR(P<0.05)、P-p70 S6K(P<0.05)及P-4E-BP1(P<0.05)的表达显著下调,与HR组比较,HPC-Exo组P-AKT无显著变化(P>0.05)但P-AMPK显著下调(P<0.05),P-m TOR、P-p70 S6K及P-4E-BP1的表达显著上调(P<0.05)。这表明,HPC-Exo显著抑制了HR诱导的AMPK/m TOR信号通路的激活但对AKT的磷酸化激活却无显著影响。(4)加入Metformin(Met)特异性激活及Dorsomorphin(Dor)抑制AMPK的磷酸化后对H9c2细胞自噬和凋亡的影响。结果显示,与HPC-Exo组比较,HPC-Exo+Met组自噬显著增强(P<0.05)而HPC-Exo+Dor组自噬被显著抑制(P<0.05);进一步观察调控AMPK的磷酸化后HPC-Exo对HR诱导的H9c2凋亡的影响。与HPC-Exo组比较,HPC-Exo+Met组PS外翻显著上调(P<0.05),ROS释放比例显著增多(P<0.05),Actived-Caspase-3及Bax的表达显著上调(P<0.05)而Bcl-2的表达显著下调(P<0.05),DNA片段化比例显著增加(P<0.05);而HPC-Exo+Dor组PS外翻显著下调(P<0.05),ROS释放比例显著下降(P<0.05),Actived-Caspase-3、Bax及Bcl-2表达无显著差异(P>0.05),DNA片段化比例显著下调(P<0.05)。这表明,在HR诱导的H9c2凋亡的基础上,AMPK/m TOR信号通路显著激活,HPC-Exo可显著抑制AMPK的磷酸化达到抑制自噬并改善HR诱导H9c2凋亡的效应。结论:(1)在HR诱导H9c2凋亡的基础上,c-kit+CSCs源Exosomes可抑制H9c2自噬水平,且HPC可增强c-kit+CSCs源Exosomes抑制自噬的作用。(2)AMPK/m TOR信号通路可能是HPC-Exo抑制HR诱导H9c2凋亡及自噬的分子机制。