桂花类胡萝卜素代谢途径的转录调控分析及桂花OfNCED3基因的功能研究

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桂花(Osmanthus fragrans Lour.)是木犀科(Oleaceae)木犀属(Osmanthus Lour.)的一种常绿乔木或灌木,是我国十大传统名花之一。(1)根据花色的不同,桂花分为银桂、金桂、丹桂和四季桂。桂花不同品种花瓣中类胡萝卜素种类和含量的不同导致花色有较大的差异。目前,许多植物中类胡萝卜素代谢途径及其相关基因已经得到了很好的阐明,但桂花花瓣中类胡萝卜素代谢途径相关基因的转录调控机制目前并不清楚。本研究通过HPLC和转录组测序分析,挖掘桂花花瓣中影响类胡萝卜素代谢的关键基因及其候选转录因子(TFs),建立关键基因和候选TFs之间的调控网络,为深入研究桂花花瓣类胡萝卜素积累的潜在转录调控机制提供有用的信息。(2)9-顺式-环氧类胡萝卜素双加氧酶3(NCED3)是类胡萝卜素代谢途径中的关键酶也是高等植物中ABA生物合成的关键酶。有研究表明高温、干旱和盐胁迫会诱导拟南芥At NCED3基因表达,导致ABA含量上升,提高植物的耐受性。目前关于桂花OfNCED3在逆境胁迫中的功能还不清楚。本研究以桂花OfNCED3-1和OfNCED3-2为研究对象,通过表达模式分析、亚细胞定位、构建拟南芥转基因株系等方法探究其在盐胁迫中的功能,为桂花的分子育种提供理论依据。主要结果如下:(1)桂花类胡萝卜素代谢途径的转录调控分析1)类胡萝卜素含量测定本实验以花色存在明显差异的‘玉帘银丝’(银桂,乳白色)、‘日香桂黄’(四季桂,金黄色)、‘大花金桂’(金桂,橙色)、‘状元红’(丹桂,橙红色)四个桂花品种的花瓣为材料,通过HPLC分析鉴定到7种类胡萝卜素,其含量和种类在不同品种中存在差异。2)转录组测序挖掘关键基因对四个品种的花瓣进行转录组测序分析,发现在‘玉帘银丝’、‘日香桂黄’、‘大花金桂’、‘状元红’中分别有1007、843、365、772个差异表达基因;进一步通过Mfuzz共表达趋势分析与WGCNA分析,发现OfDXS2、OfCCD1、OfGGPPS2、OfDXR3、OfBCH2和OfCCD4是影响桂花花瓣类胡萝卜素积累的关键基因。3)关键基因转录因子的预测对关键基因的启动子进行转录因子预测和Pearson相关性分析,发现19、16、21、47、21、29个候选TFs分别与OfDXS2、OfDXR3、OfCCD1、OfGGPPS2、OfBCH2和OfCCD4具有很高的相关性系数(|r|≥0.80),暗示这些转录因子可能参与调控其靶基因的表达,影响花瓣中类胡萝卜素积累。本实验通过转录组和HPLC分析找到了影响桂花类胡萝卜素代谢的关键基因及其相应的转录因子,建立了关键基因和候选TFs之间的调控网络,为深入研究桂花中类胡萝卜素积累的转录调控机制提供了有用的信息。(2)桂花OfNCED3基因的功能研究1)OfNCED3-1和OfNCED3-2的基因克隆,亚细胞定位及表达模式分析为研究桂花OfNCED3在适应逆境胁迫中的功能,本实验成功克隆了OfNCED3-1与OfNCED3-2基因;序列比对发现OfNCED3-1和OfNCED3-2与其他物种的NCED3有高度同源性且均具有CCD家族基因特有的RPE65结构域;通过不同组织表达模式分析,发现OfNCED3-1和OfNCED3-2的表达量均在叶和根中较高,茎和花中表达量较低;通过盐胁迫处理桂花枝条,分析基因表达模式,发现叶片中OfNCED3-1和OfNCED3-2的表达量均显著提高,其表达模式都是先上升后下降;瞬时过表达烟草下表皮细胞并观察其亚细胞定位发现二者定位于细胞膜上、叶绿体和细胞质。2)OfNCED3-1和OfNCED3-2转基因鉴定及功能的初步分析为探究桂花OfNCED3-1和OfNCED3-2的基因功能,本实验利用浸花法将OfNCED3-1与OfNCED3-2基因成功转化拟南芥植株并对两种阳性转基因植株进行盐胁迫处理,发现OfNCED3-2转基因植株的生长状况显著好于野生型。
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